什么是无性杂交？

使两个亲本的原生质体融合成为一个具双亲遗传物质的杂种细胞，并在人工培养下使之形成杂种果树的杂交方法。无性杂交不受亲缘关系限制，特别是某些不能有性杂交的果树，可以采用无性杂交方法育种，培育新的果树类型。其选择杂交亲本的范围比有性杂交更广泛，遗传基础更复杂。因此无性杂交对果树遗传和育种的研究具有重要的意义。

生物学家在20世纪60年代初开始研究体细胞杂交技术，如异种DNA分子的引入，线粒体，叶绿体和核的移植，或原生质体的融合等。70年代以来，通过原生质体融合技术，已成功地获得烟草，矮牵牛的种间或品种间杂种。1985年的枳壳与Trovita橙的原生质体融合获得的植株，是柑橘无性杂交所取得的最新成果。

无性杂交技术，一般包括原生质体的分离，异种原生质体的融合，异核体的选择和培养成细胞团，然后再分化成植株。例如日本小林省藏等（1985年）从Trovita甜橙的珠心胚和枳壳实生苗的叶片分离的原生质体，用PEG6000为细胞融合剂，在MT培养基中添加0.6M的蔗糖和0.6%琼脂，原生质体接种密度为105/毫升，培养后由枳壳来的原生质体逐渐消失，甜橙原生质体逐渐形成不定形的白色群落，并进一步形成绿色的胚状体，将胚状体转入分化培养基继续培养，便发育成具有三出复叶的植株，其染色体数36条，为双二倍体，并从叶精油成分分析结果，也确认是由体细胞融合的杂种。

外源DN A分子的导入，采用基因工程进行异种基因的转移。大致步骤为：获得目的基因；目的基因与载体结合成重组DNA分子；重组DNA分子引入受体细胞，再筛选和表达。

细胞器的摄取，采用甲种原生质体摄取乙种细胞的质体，线粒体，叶绿体或核等细胞器，从而产生新型的杂种细胞。

吴耕民（1896～1991）中国园艺学家、农业教育家，中国近代园艺事业奠基人之一。1896年3月17日生于浙江省余姚县。1914～1917年就读于北京农业专门学校农科，1917年赴日兴津园艺试验场研修园艺。1920年回国后在母校任教，1921～1927年任东南大学副教授。1927～1933年任浙江大学农学院园艺系主任兼副教授、教授。其间（1929～1930年）曾去英国、法国、德国、比利时、瑞士考察园艺植物栽培。1933年后历任青岛农林事务所特约研究员、山东大学农学院教授、西北农林专科学校园艺系主任、教授兼园艺场场长、浙江园艺改良场场长、广西大学农学院教授，1939年又回浙江大学农学院任园艺系主任兼教授。1943年起受聘为重庆政府教育部部聘教授，曾兼任浙江省农业推广委员会主任、技正。1949年中华人民共和国成立后，在浙江大学农学院园艺系任原教职，曾兼任农业部顾问、中国农业科学院第一届（1957～1980）学术委员会委员，曾被选为中国园艺学会第四届名誉理事长，并担任《中国果树》、《中国柑橘》等期刊的编委。

吴耕民曾参加了创建东南大学园艺系、浙江大学农学院园艺系、西北农林专科学校园艺系及浙江园艺改良场的工作；在教学方面长期担任果树园艺、蔬菜园艺和花卉园艺等课程，编写了多种讲义和教材。在果树园艺方面出版的著作主要有《果树园艺通论》（1948）、《枣栗柿栽培》（1964）、《果树修剪学》（1979）、《中国温带果树分类学》（1984）、《日英汉农林园艺辞汇》（1987）等，以及有关论文数十篇。他曾为中国果树、蔬菜、花卉的引种和选种研究作了大量工作，如在陕西工作期间引入的有西洋苹果、桃、梨等，浙江省西湖蜜梨是最早由他引入的。他还率先调查研究了肥城桃、莱阳梨、灵宝枣、云贵核桃等中国特产果树。他在研究总结传播近代园艺科学知识和培养园艺人才方面作出了贡献。

物候期

植物器官受一年内季节气候条件制约而发生相应的动态变化。多年生果树每年从春季开始萌芽后，随着季节气候的变化，有规律地进行着蘖芽、抽梢、开花、结实以及根、茎、叶、果等一系列的生长发育活动，这种年复一年的规律性变化，即为年发育周期。落叶果树的年发育周期中，可明显地分为生长期和休眠期两个时期；常绿果树没有明显的休眠期。在生长期间，果树各器官随着每年气候变化，在形态上和生理上表现出显著的特征，即表现出不同的物候规律。因此物候期既反应了果树器官发生的动态，又反映了当时的气候条件与过去一段时间光热的积累情况。

物候期的观测，在中国自古就为人重视。最早见于《诗经·豳风》：“八月剥枣，十月获稻”；吕祖谦（公元1137～1181年）对24种植物的开花期和结实期作了实测记录，其中有李、桃、梅、海棠等果树。20世纪60年代初，中国将银杏、核桃、栗、苹果、桃、杏、枣列为物候期观测对象。各种果树在不同地区物候期的数据可作果树种类、品种区域划的依据。物候期也是当地制定栽培技术措施的根据。日本曾保存了1000余年的樱花开花期记载，对研究物候期有重要参考价值。

果树物候期的观测

果树的物候期，一般选择在形态上有明显标志的阶段，如芽膨大期、萌芽期、新梢生长期、开花期、果实成熟期、花芽分化期、根系活动期等。但不同果树观测的物候期不尽相同，如落叶果树有落叶、休眠等期，葡萄有树液流动期。为了便于生产管理和科学研究的需要，常将物候期细分为若干物候分期。各物候期和物候分期的标志是：①萌芽期、芽膨大、鳞片绽开到幼叶分离时期。可细分为芽开始膨大期和展芽期。②开花期。花蕾迅速膨大、开花到花瓣脱落时期。可细分为初花期（全树有5%的花开放）、盛花始期（全树有25%的花开放）、盛花期（50%的花开放）、盛花末期（75%的花开放）、落花始期（5%花的花瓣脱落）、终花期（95%花的花瓣脱落）。③新梢生长期。新梢开始生长到顶芽形成时期。可细分为新梢开始生长期，即从芽萌动到幼叶伸出芽外和节间伸长与幼叶分离的时期；新梢旺盛生长期，即新梢明显伸长，幼叶迅速分离与叶片增多的时期；新梢缓慢生长及停止生长期，即新梢生渐趋缓慢直到形成顶芽的时期。有的果树一年内发生多次新梢，每次均可细分为：开始生长期，停止生长期。④花芽分化期。芽出现到芽内雌雄蕊形成时期（见花芽分化）。⑤果实发育成熟期，即从花受精、果实肥大到果实成熟时期。可细分为落果期（包括第一期落果、生理落果、采前落果）、果实迅速生长期、果实缓慢生长期、成熟期。果实成熟期是全树有50%的果实具有该品种色泽与品质的特征，采摘时果梗易分离时期。⑥落叶休眠期。即开始落叶到全部叶片落完的时期。可细分为落叶始期（全树有5%的叶片脱落）、落叶盛期（25%的叶片脱落）、落叶终期（全部叶片正常脱落）。⑦根系活动期。果树根系在年生长周期中没有自然休眠现象，但一年中一般有2～3次生长高峰。

物候期观测时，可根据不同果树、不同目的选重点项目观测记录。

影响物候期的因素

不同果树种类或同一果树不同品种的物候期不同。不同地区果树物候期出现的早晚，则是地区间气候冷暖干湿程度的反映。影响地区间物候期差异的因素有：①纬度。纬度越高，温度越低，春季物候期越晚。②海拔高度。海拔越低，温度越高，春季物候期越早。③海陆分布。受海洋气流影响的地区，气温变化平缓，春季物候期延迟；④地形。盆地和谷地冷空气容易聚集，无霜期比周围略高之处为短，早春物候期较晚，北坡比南坡的开花期亦较迟。

不同地区桃始花的日期不同（图1）。

果树物候期的特性

主要有：①物候期的顺序性。在年发育周期中，果树的各物候期呈现一定的顺序性，即每一个物候期都是在前一个时期通过的基础上进行，同时又为下一个时期作准备。例如，开花期是在萌芽的基础上发生的，并为果实发育做准备。不同树种间，物候期的顺序不完全相同，例如桃、杏先开花后展叶，苹果、梨先展叶后开花。②物候期的重叠性。果树器官的动态变化是连续的，故有些物候期之间的界限并不十分明显，呈现出一定的交错重叠性，即在同一树上可以同时表现出几个物候时期。例如在热带及亚热带常绿果树上，有的枝处于开花期，而另一些枝却处在果实发育或果实成熟期；如温带落叶果树的新梢生长、果实发育、花芽分化与根系活动物候期均交错并进（图2）。③物候期的重演性。有些树种的物候期在一个年生长周期中可重复发生。例如，葡萄在一年中可多次开花，多次结果；有些果树在遇到灾害后可能出现物候期的重复发生，如枣树的枣吊受害后，枣股可多次萌发枣吊。

图1

图2果树物候期的变化，表明果树与外界环境条件的矛盾统一。果树物候期代表了果树在一年中生长发育的进程，同时也反映了一年中气候的变化。开展全国各地主要果树物候期观测，累积历年的物候期记录，可作为各地果树物候预报的根据，对果树生产十分有益。

专利名称：三系法杂交油菜冬播制种技术的制作方法

技术领域：

本发明属于杂交油菜胞质雄性不育三系杂种优势利用领域。

关于油菜杂种优势利用，近几年来国内外均十分重视，并且都取得了一定进展，但真正成功并用于生产而取得显著效益者，仅只有我国陕西省农垦科技教育中心发明人李殿荣选育的《甘兰型油菜三系杂交制种及栽培技术》，专利号86108723.2，该发明选育甘兰型油菜胞质雄性不育三系(不育系、保持系、恢复系)，选育不育系陕2A作母本，保持系陕2B作父本杂交，繁殖陕2A不育系，用不育系陕2A作母本，恢复系垦C1作父本杂交，配制的强优势组合的秦油2号杂交种，以及配套的高产栽培技术，使杂种含油量不降低的前提下(同当前推广品种相比)，能够较大幅度地提高油菜单位面积产量，为我国大面积推广杂交油菜提供了一个增长效益极为显著的第一个三系杂交种。自审定合格以来，长江流域各省迅速推广杂交种，但由于异地调种，不仅要花费大量人力、物力，因路途遥远，交通运输不便，而且有时会延误季节，造成巨大经济损失。故长江流域诸省，如四川、贵州、湖北、安徽等省均引进亲本制种，但在该地域制种初花到盛花期往往出现微量花粉，产生自花结实，影响种子纯度，配制的种子不能用于生产，均未获成功。1988年秋季，贵州省遵义县山岔乡配制秦油2号170亩，收获种子1.3万Kg，1989年秋播14万亩，于90年4月初开花期发现，种子纯度仅20～50％，有50～80％的植株是不育株，导致减产30～50％，就是从陕西省渭南、宝鸡等地区配制调进的秦油2号杂交种，经大面积多点调查，种子纯度也仅80％左右，但如果能够将种子纯度再提高10％达到90％左右，就可达到再增产5～8％的目的。因此，就地配制油菜杂交种，并提高种子纯度，正是生产上急待解决的问题。

本发明的目的正是针对生产所需，进行陕2A微粉发生规律的研究并利用规律进行制种，就地配制高纯度的杂交种子，对海拔在800～1200公尺的贵州省遵义地区乃至长江流域诸省解决杂交油菜种的制种技术，为解决生产急需，大面积提高油菜单位面积产量，增加经济和社会效益。

本发明的技术方案是这样实现的。

首先对杂交油菜不育系陕2A进行育性变化规律研究1.对陕2A和垦C1从10月到来年2月每月分两期播种；2.对陕2A花朵初花、盛花和终花全面观察，记载有无粉情况；3.利用陕2A无粉播种期处理进行制种试验；4.重复三年。第一年从四个方面进行观察、不同开花时期即初花、盛花和终花期的抽样观察，不同花序部位100株大样本的抽样观察，整株全部花朵的观察。第二、三年是根据上年的情况重复进行。其次对与不育系陕2A类似的不育系如1356A、32A、早32A、G3A、3A等胞质不育或核质互作的不育系分两期播种，秋播育苗移栽、冬播直播。造成第一期(9月上旬)秋播的在来年的3月下旬到4月上旬开花。第二期(12月上旬)冬播的在来年的4月下旬开花，分别记载观察花朵有无花粉。四年来的整个试验研究，近3000个观察数据及其2000多个统计资料记载、统计、分析得出所有胞质不育的甘兰型不育系，其育性都具有感温性的特点，育性的变化受着花粉形成时期的温度控制，微量花粉随温度升高而明显减少，以至转变为彻底不育。开花期日均温为15～20℃时，不育系花朵中无粉或极少有花粉。

按探索到的以上规律拟定制种技术主要是在11、12月和翌年元月，将不育系陕2A作母本、保持系陕2B作父本、繁殖陕2A不育系，不育系陕2A作母本，恢复系垦C1作父本杂交配制秦油2号杂交种。并用如上所述的与不育系陕2A类似不育系的播种期也从原秋季(9月、10月)改为冬季(立冬至立春)。油菜冬播和秋播，幼苗期的气温条件不同，苗架长势也不一样。冬播的幼苗，因遇低温严寒，长势缓慢，待开春后才加速生长，然而又很快进入开花期，所以植株因营养生长期短而变得矮小，为获高产，采取加大密度，多留苗，适宜行比，精细整地，用好底肥，及时匀苗定苗，全面用肥，及时追苗肥、苔肥、偏管父本。安全隔离，以时间隔离和空间隔离相结合。人工辅助授粉，去杂去劣等技术措施，这样配出的杂交种纯度可达85～95％，产量高，一般亩产40Kg，高产田可达50Kg。

本发明三系法杂交油菜制种技术秋播改冬播不仅有效地控制了微粉的发生，提高了制种质量，而且在秋播难以实现空间安全隔离时可利用冬播带来的时间隔离，降低了开花期的微粉率和提高异交结实率，实现了甘兰型油菜胞质雄性不育“三系”及其类似不育系在长江流域能配制出高纯度和高产量的杂交种，克服了长途运输难，解决了就地制种供种，节约了大量人力、物力、大面积的提高了单位面积产量，一般亩产油菜40Kg，高产田可达50Kg，增加了经济和社会效益。

下面以海拔在800～1200公尺的贵州省遵义地区利用不育系陕2A及其类似不育系，冬季配制秦油2号杂交种的制种技术为例叙述本发明的实施例。

引陕西省农垦科技教育中心的不育系陕2A作母本，保持系陕2B作父本杂交，繁殖陕2A不育系，不育系陕2A作母本，恢复系垦C1作父本改秋季(9、10月)播种为冬季(立冬至立春)播种杂交配制秦油2号杂交种。

1、适期播种。母本和第一期父本播期为11、12月或翌年元月，第二期父本播期比第一期父本晚播半月。

2、合理密植。要求苗数结构是1∶5的父母本行比，每亩母本2.9～3.1万株，父本0.58～0.62万株，1.0×0.5尺的行株距，每亩播种1～1.2万窝，每窝留苗3～4株。

3、精细栽培管理。要求精细整地、清除杂草。用好底肥，用磷肥、硼肥、土杂肥和清粪作底肥，及时匀苗定苗。全面用肥，及时追苗肥、苔肥，要求亩用纯氮15Kg、五氧化二磷10Kg，氧化钾10Kg、硼肥2Kg、锌肥1Kg。偏管父本，对父本偏追肥二次，并在开花前喷施“920”，提高父本植株高度，以利授粉。

4、安全隔离，防杂除杂。采用时间隔离与空间隔离相结合的方法。空间隔离在制种区油菜和非制种区的十字花科作物在同期开花又无其它屏障隔离的情况下，空间隔离距离最少为2000M。改秋播(9、10月)为冬播(11、12月或翌年元月)，使制种区的油菜始花时，周围非制种区的十字花科作物已终花结束.全过程除杂，从出苗到收获，凡发现杂株都要及时拔除，将杂株率控制在千分之一以下。为防止特殊年份气候变化出现微粉，要进行微粉检查，初花期要随时检查主轴或分枝的花朵中有无花粉，如出现花粉，及时拔除。并且在授粉结束后，立即把父本割除，并妥善处理好残株。

同时，还要防治病虫害，辅助授粉和及时收获及对种子进行纯度检验。经检验合格即可投入生产使用。

利用与不育系陕2A类似的不育系，如1356A、32A、G3A、早32A、3A按上述制种技术进行制种和栽培试验，同样可达到以上效果。

权利要求

1.一种三系法杂交油菜冬播制种技术的方法，选不育系陕2A作母本，保持系陕2B作父本杂交，繁殖陕2A不育系，不育系陕2A作母本，恢复系垦C1作父本杂交配制秦油2号杂交种，其特征在于利用不育系陕2A及其类似不育系，将播种期从秋播改为冬播，合理密植，安全隔离，配制出纯度高达85～95％的杂交油菜种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用与陕2A类似的不育系如1356A、32A、G3A、早32A、3A进行配制杂交种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于不育系陕2A及其类似不育系适宜的播种期由秋季(9、10月)播种改为冬季(立冬至立春)播种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于合理密植要求苗数结构是1∶5的父母行比，每亩母本2.9～3.1万株，父本0∶58～0.62万株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于安全隔离技术采用时间隔离和空间隔离相结合的方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所指的空间隔离即制种区油菜和非制种区的十字花科作物在同期开花又无其它屏障隔离的情况下，空间隔离距离最少为2000M。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所指的时间隔离即制种区的油菜始花时，周围非制种区的十字花科作物已终花结束。

全文摘要

本发明提供一种三系法杂交油菜冬播制种技术，利用不育系陕2A及其类似不育系作母本，在冬季播种可控制微量花粉的产生，实现时间隔离与空间隔离相结合的安全隔离措施，提高种子纯度。该技术适宜于长江流域就地制种，能减少长途运输，提高单产，一般亩产40公斤，高产田可达50公斤，大幅度提高经济和社会效益。