叶子花属的亲缘关系

叶子花属(Bougainvillea L.)是紫茉莉科(Nyctaginaceae)植物，全世界约有18种。本属观赏种质大多由叶子花(Bougainvillea spectabilis Willa．)、光叶叶子花(B. glabra Choisy)以及秘鲁叶子花(B. peruviana H.B.)3个原种经过自然杂交、人工育种等，形成了包括原种、杂交种、栽培种等种质数量近300个品种之多的庞杂体系。我国经引种栽培和培育的叶子花品种约有100个。目前国内外关于叶子花分子生物学方面的研究报道较少，在DNA水平上的遗传多样性研究虽有报道但方法单一而缺乏系统性，限制了叶子花资源的开发和利用。本研究以48份叶子花样本为材料，运用RAPD、ISSR、SRAP三种标记对其进行遗传多样性评价和亲缘关系分析。主要研究结果如下： 1.以改良的CTAB法提取叶子花基因组DNA，提取的DNA能够满足RAPD、ISSR和SRAP分析的要求。 2.采用单因素结合正交设计的方案，优化并建立了适合于叶子花遗传多样性分析的RAPD、ISSR和SRAP反应体系。 3.48份叶子花种质的遗传多样性水平： 7条RAPD引物对供试的混合DNA样本进行分析，共检测出来97条带，其中多态性条带97个，多态带百分率达100%；多态性信息含量(PIC)平均值为0.890，观测等位基因数(Na)平均值为2.0000，每个位点的有效等位基因数(Ne)平均值为1.4595，Nei’s基因多样多样性指数(H)平均值为0.2803，Shannon信息指数(I)平均值为0.4340。 11条ISSR引物对供试的混合DNA样本进行分析，共检测出来140条带，其中多态性条带140个，多态带百分率达100%；多态性信息含量(PIC)平均值为0.835，观测等位基因数(Na)平均值为2.0000，每个位点的有效等位基因数(Ne)平均值为1.4189，Nei’s基因多样多样性指数(H)平均值为0.2579，Shannon信息指数(I)平均值为0.4040。 25对SRAP引物对供试的混合DNA样本进行分析，共检测出来773条带，其中多态性条带750个，多态带百分率达97.02%；多态性信息含量(PIC)平均值为0.9463，观测等位基因数(Na)平均值为1.9702，每个位点的有效等位基因数(Ne)平均值为1.4721，Nei’s基因多样多样性指数(H)平均值为0.2818，Shannon信息指数(I)平均值为0.4314。 从遗传多样性参数上看，三种标记均揭示叶子花观赏种质具有较高的遗传多样性水平，标记能力从大到小依次为：SRAP标记RAPD标记ISSR标记。 4.三种分子标记的聚类结果显示，均能清楚地将48份样本定位区分开来；但三种标记方法对类群的划分结果存在差异，比较而言，其中ISSR与SRAP标记一致性程度较高。大多样本遗传相似性大，亲缘关系近，就所研究的样本看，叶子花种质除少数样本外，基本可分为两大种系来源：一是B. glabra种系，其品种大多以其种内来源为主；二是涵盖了B. spectabilis、B. peruviana、B.×buttiana和B.×spectoglabra四个种的种系，种质构成较为复杂。分子标记对一些形态上无法细分的品种(类群)，是可靠的鉴别方法。综合三种分子标记的数据聚类所得结果与单一SRAP标记的基本一致，说明SRAP标记在稳定性、多态性等方面比其他两个分子标记更有优势，更能反映种质样本间的差异。

花的形成经历了一系列过程：首先，开花诱导激活了花分生组织特征基因，从而产生花分生组织[1,2]；随后，花分生组织特征基因激活了花器官特征基因，在花器官特征基因的严格控制下，分生组织发育成花；最后，花器官特征基因激活下游决定各组织和细胞类型的基因，从而形成各类型器官。每个步骤都受到严格的遗传控制，通过这些基因特定的时空表达及相互作用来精细调节花形态建成的网络。人们发现，在模式植物如金鱼草、矮牵牛、拟南芥、玉米、水稻里，它们遵循几乎相同的表达模式[3～6]。

1 经典ABC 模型的确立

花器官特征基因最早是在拟南芥和金鱼草中发现的。这些双子叶植物的花由同心圆的四轮结构组成，从外向内依次为：第1 轮萼片，第2 轮花瓣，第3 轮雄蕊，第4 轮心皮。在这两种植物中，花器官的同源异形突变体有一个共同的特征，即相邻两轮器官的发育同时受到影响。按照变异器官分布的空间顺序，这些突变体分为三类：第一类突变体的萼片转化为心皮，花瓣转化为雄蕊，导致花的组成由外至内依次为心皮- 雄蕊- 雄蕊-心皮；第二类突变体将花瓣转化为萼片，雄蕊转化为心皮，花组成为萼片- 萼片- 心皮- 心皮；第三类突变体雄蕊转化为花瓣，心皮转化为类似萼片的结构，花组成为萼片- 花瓣- 花瓣- 萼片，并且在心皮内不断产生不确定的花器官，这些花器官类似于萼片与花瓣组织[7～9]。通过对决定这些突变体的同源异形基因的研究，把这些基因相应地分为a，b 和c 三类，并随之提出ABC 基因表达模型[10]。在经典ABC 模型中，花器官是由A，B 和C 三类器官特征基因共同表达的结果。A 类基因单独控制萼片的形成；A 类和B 类基因联合控制花瓣的发育；B 类和C 类基因共同决定雄蕊的形成；C类基因单独调控心皮的形成。A 类基因和C 类基因相互抑制，当C 类基因丧失功能后，A 类基因在花的整个发育时期表达，反之亦然[11～13]。

在拟南芥中，APETALA1(AP1)和APETALA2(AP2)属于A 功能基因，APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)属于B 功能基因，AGAMOUS (AG) 属于C 功能基因[7,9,14]。AP3，PI 和AG 基因中任何一个发生突变都不能产生雄蕊。AP3，PI 和AG 最初在花分生组织的雄蕊原基中表达，随后在发育成熟的雄蕊中也能检测到它们的表达信号[15～17]。AP3，PI 和AG 的异位表达在花中产生了异位雄蕊[18～20]。AG 的RNA 也可以在心皮原基中表达[17]。AP1 既是花分生组织的特征基因，又是花器官的特征基因。在花分化初期，它在整个花原基里表达；在花器官分化阶段，AP1 在萼片和花瓣中表达[21,22]。对决定花器官突变体基因的研究表明，除了AP2 外，所有与花器官发育相关的功能基因都是转录因子，含有一个高度保守的DNA 结合结构域，属于MADS- box家族。这些转录因子与相应DNA 区域结合调控该基因转录[7,9]。

综上所述，ABC 模型有3 个基本原则：第一，每一个类型的同源异型基因作用于相邻的两个轮，当基因突变时其所决定的花器官表型发生改变；第二，花同源异型基因的联合作用决定器官的发育；第三，A 类和C类的基因表达不相互重叠。由于经典ABC 模型较好地解释了花同源异型基因的表达模式，阐明了花器官突变的分子机制，并能够预测单突变，双突变和三重突变体花器官的表型，所以被广泛接受。但是随着研究的深入和克隆出的花同源异型基因数量的增加，出现了许多该模型无法解释的现象。如ABC 三重突变体的花器官除了叶片外仍含有心皮状结构，而不像预测的那样不再含有任何花器官状组织[23,24]。这预示着还存在有与AG 功能相近的能促进心皮发育的基因。随后的研究发现两个新基因CRABSCLAW(CRC)和SPATULA(SPT)，具有类似于AG 的功能并促进心皮的分化。在ABC 三重突变体中，如果继续使CRC 和SPT 基因功能丧失，能够减少心皮组织的数目。在ap2 pi ag spt 四重突变体中，在叶状花里仍能产生胚珠状的花器官结构，说明除了以上报道的基因外，仍存在有影响心皮组织发育的基因，可能的基因为LEUNIG 和AINTEGUMENTA[25]。对这些问题的深入研究扩展了经典的ABC 模型。

2 D 功能基因的阐明

对矮牵牛中影响胚珠发育突变体的研究发现，存在有决定胚珠发育的MADS- box 基因FLORALBINDING PROTEIN7(FBP7)和FBP11，它们同时也影响种子的发育[26,27]。FBP11 在胚珠原基、珠被和珠柄中表达，转基因植株的花上形成异位胚珠或胎座。如果干扰FBP11 的表达，就会在应该形成胚珠的地方发育出心皮状结构。这个发现使人们认识到还存在有与C 类基因功能部分重叠的D 类基因[28～30]。

拟南芥中与FBP11 同源的D 功能基因是AGL11（后被重新命名为STK）。FBP11 和STK 都属于MADS- box 基因家族，和属于C 类基因的AG 亲缘关系较近，有相似的基因表达模式[7,9,31]。后来的研究表明，另外的两个基因SHATTERPROOF1 (SHP1)，SHATTERPROOF2（SHP2）也是D 功能基因，它们和AG、STK 互为冗余地控制着胚珠的发育。虽然在ag 单突变体中不能够产生正常的心皮和胚珠，但是在排除了A类基因AP2 作用后，在ap2 和ag 的双突变体中仍能看到心皮状和胚珠状结构。在ap2 ag 的双突变体中，继续剔除SHP1 或SHP2 后，这些心皮状结构也随之消失。3 个D 类基因STK、SHP1、SHP2 分别或同时突变，都能使胚珠和种子发育受阻，部分胚珠转化成为叶状或心皮状组织。SEP 基因也是影响胚珠发育的D 类基因，因为sep1 sep2 sep3 三重突变体的心皮完全丧失，但是这个突变体与SEP1 杂交后代的部分胚珠转化成为叶状和心皮状结构，类似于stk shp1 shp2 三重突变体[32]。尽管SEP3，SHP1 和STK 的联合表达并不足以使营养组织转化成心皮或胚珠结构，但在酵母中这些蛋白相互作用的产物与植物体中的非常相似，证明这些复合物在生命体中有着重要功能[13]。

最近，在拟南芥中报导了与B 类基因关系密切的Bs(Bsister)类基因，包括拟南芥的ABS（Arabidopsis B- sistergene）和矮牵牛的FBP24 基因，该类基因影响胚珠内皮层的发育[33]。在蛋白质水平上的研究揭示了，Bs 类基因可以和C、E 类或D、E 类基因的表达蛋白相互作用形成Bs- C- E 或Bs- D- E 高级蛋白复合体[34,35]。这可能是D 类基因中的一个新的类型。

3 E 功能基因的发现

通过调控ABC 基因的表达，可以人为地操作每轮花器官发育状态，但是，却无法使叶片转变成花器官[19,36]。由此可见，这些基因虽然对花器官的发育至关重要，但是它们并不是营养器官转化成花器官的充分条件。这预示着由营养器官向花器官转变还有另一类花特征基因参与。最近，在寻找与ABC 类基因相互作用的蛋白时发现了这类SEP 基因[37]。酵母双杂交实验揭示出在花分生组织中表达的一些AG 家族基因，如AGL2，AGL4 和AGL9 就是这类基因。它们先于B 和C类基因表达[38]。AGL9 可以同AP1 与PI- AP3 复合体相互作用还可以形成PI，AP3 和AG 蛋白四聚体[37,39]。AGL2，AGL4 和AGL9 基因的三重突变体的花器官每轮仅产生萼片，因此，这些基因被重新命名，AGL2 为转化为花瓣。这至少表明，AP1，PI，AP3 和一个SEP 基因共同决定花瓣的发育。

通过对这些基因表达蛋白的相互作用的研究，人们推测这些复合体以四聚体形式存在：2A+2SEP 决定萼片[39]；A+2B+SEP 决定花瓣；2B+C+SEP 决定雄蕊[46,47]；2C+2SEP 决定心皮[38]。由于这些复合体能够使叶片转化为花器官，不同的同源异型蛋白复合体决定特异的花器官。因此它们SEPALLATA1（SEP1），AGL4 为SEPALLATA2（SEP2），AGL9 为SEPALLATA3（SEP3）[40]。这个三重突变体的表型类似于B 和C 类基因的突变体表型，但是B 和C的表达没有变化，在B、C 类基因双突变体中，SEP1、SEP2 和SEP3 基因仍然有表达，所以B、C 类基因和SEP 基因之间没有上下游关系[9]。随后的研究证明SEP的蛋白复合体能够激活AG 的下游基因SHP2，完成花器官的发育[41]。这类基因和其它类基因联合作用，可以完成营养器官向生殖器官的转变，如SEP3 可以与B、C 类基因联合表达能够使叶片转化成雄蕊[37,42,43]。这类基因既不属于B 功能基因，又不属于C 功能基因，被新命名为E 功能基因[40]。最近发现，AGL3 基因与SEP1，SEP2 和SEP3 有着类似的功能，决定着萼片的特性，属于第四个SEP 基因，并被命名为SEP4[44]。sep1,sep2 和sep3 三重突变体的花瓣，雄蕊和心皮均转化为萼片[40]，sep 四重突变体所有的4 个轮都转变成为叶状结构，只残存部分类似心皮的组织，与缺少ABC功能的三重突变体表型类似[44,45]。在拟南芥中，ABC 类基因与SEP 基因联合表达可以使叶片转化成为完整的花器官，证明了ABCE 基因联合作用决定了花器官特征[37,43]。