青蒿素是什么植物提取的?

青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，由中国药学家屠呦呦在1971年发现 。青蒿素是继乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后最有效的抗疟特效药，尤其是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾，具有速效和低毒的特点。

被世界卫生组织称做是“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”。

萜类化合物的生物合成途径非常复杂，对于青蒿素这一类低含量的复杂分子的生物合成研究更是如此。用以下三种途径可生物合成青蒿素：

1、通过添加生物合成的前体来增加青蒿素的含量。

2、通过对控制青蒿素合成的关键酶进行调控，或者对关键酶控制的基因进行激活来大幅度增加青蒿素的含量。

3、利用基因工程手段来改变关键基因以增强它们所控制酶的效率 。

生物合成

青蒿素存在于中草药青蒿的花叶中，茎中不含有，是一种含量非常低的萜类化合物，生物合成途径非常复杂。

目前可通过三种方式进行青蒿素的生物合成，一是通过对控制青蒿素合成的关键酶进行调控，添加生物合成的前体来增加青蒿素的含量； 二是激活关键酶控制的基因，大幅度增加青蒿素的含量； 三是利用基因工程手段改变关键基因，以增强它们所控制酶的作用效率。

生物合成过程中，青蒿素的含量受光照、外源激素、芽分化等生理生态因子的影响很大，温度对于生物合成也有极大影响，通过试验研究发现，青蒿幼苗在 40 ℃ 条件下，处理36 h 后，青蒿素的质量分数提高到最大为 68%。

除青蒿之外，其它植物也可以合成青蒿素，2011 年研究人员从烟草中合成青蒿素。此方法与传统化学方法相比，所用的化学试剂大大减少，有利于环境的保护，且该生物合成方法的受体为烟草，在中国较为广泛，因此原料来源较为丰富，但不足的是用烟草合成青蒿素过程中的某些反应基质并不清楚，还有待开发，但该合成方法仍有较好的工业应用前景。

将一个青蒿基因植入大肠杆菌，改造后的大肠杆菌制造出一种中间化合物，这种化合物经过数步处理就能成为青蒿素的原料——青蒿酸。把一种特殊的酶植入酵母后，酵母把前面提到的中间化合物改造成了青蒿酸。通过微生物工业生产青蒿素的技术链条已经基本成形。这意味着青蒿素的价格将下降90%。

细胞自噬

考点1：氯喹

药动学 口服后在肠道吸收快、完全，1～2h达血药浓度高峰。吸收后，很快分布到肝、胃、脾、肺和红细胞内。红细胞内药物浓度比血浆内高 10～20倍，而疟原虫侵入的红细胞内浓度又是正常红细胞浓度的25倍，这为氯喹杀灭红细胞内的裂殖体及迅速控制症状提供了良好的条件。氯喹在肝、肾、 脾、肺中的浓度为血浆浓度的200～700倍。本品在肝内代谢，其脱羟基代谢物仍有一定的抗疟作用，10%～20%以上以原形经肾排泄，因其代谢与排泄均 慢，内脏组织内贮存量大，停药后药物又逐渐释放入血，故作用时间长，t1/2约48h，其具有长效特点。

抗疟作用 氯喹首选用于控制临床症状，具有强效、速效、长效的红细胞内期裂殖体杀灭作用。用药1～2天内寒战、发热、出汗等症状大多消退。 2～3天内血中裂殖体即可消失。氯喹对间日疟原虫和三日疟原虫及敏感的恶性疟原虫的红细胞内期裂殖体有杀灭作用，各种疟疾的症状均能有效控制。虽对红细胞 外期无效，既不能预防，也不能根治间日疟，但因作用持久，故能延迟良性疟的复发。因恶性疟原虫无红细胞外期，故可根治恶性疟。氯喹虽不能直接杀灭配子体， 但通过杀灭裂殖体而使其减少，少数残存的配子体可被机体防御功能消灭，因而在一定程度上阻断疟疾的传播。

临床应用

1.治疗疟疾。本药具有作用强、起效快、疗效持久等特点，为目前控制临床症状的首选药物。能迅速控制延缓良性疟的复发，根治恶性疟。由于Ca2+ 和钙调素对疟原虫生长发育和侵入红细胞的能力有重要影响，故钙拮抗剂能增强氯喹的抗疟效果，如维拉帕米能逆转恶性疟原虫对氯喹的耐药，增强氯喹的抗疟作 用。

2.治疗肠外阿米巴病。氯喹在肝中浓度很高，是治疗阿米巴肝脓肿的主要药物。

3.治疗自身免疫性疾病。如氯喹偶尔用于类风湿性关节炎，也常用于蝶形红斑狼疮、肾病综合征等，但对后者的疗效尚无定论。

不良反应 治疗剂量下，氯喹不良反应少，可出现头晕、头痛、胃肠道反应、皮疹、剥脱性皮炎、粒细胞减少等，停药后迅速消失。长期大剂量应用 可引起蓄积中毒，血浓度大于0.8μg/ml时将发生较严重的不良反应，常有角膜浸润、视力模糊等眼毒性，故应定期检查。偶见心肌损害，窦房结抑制，甚至 发生阿-斯综合征。

禁忌症 有致畸作用，孕妇禁用。剂量大于5g可致死。

☆ ☆☆考点2：青蒿素

药动学 口服吸收快而完全，广泛分布于各组织。因其脂溶性高，易通过血脑屏障，故对脑型疟有效。体内代谢快，代谢产物经肾排泄也快，有效血药浓度维持时间也短，不利于杀灭疟原虫，复发率高，t1/2约为4h.

抗疟作用 对红细胞内期裂殖体有强大而迅速的杀灭作用，有高效、速效、低毒的特点，对红细胞外期裂殖体无效。主要用于治疗间日疟和恶性疟， 症状控制率可达100%.与氯喹只有低度交叉耐药性，对耐氯喹虫株感染仍有良好疗效。可通过血脑屏障，对凶险的脑型疟有良好的抢救作用。青蒿素抗疟作用机 制可能是血红素或Fe2+催化青蒿素形成自由基破坏疟原虫表膜和线粒体结构导致疟原虫死亡。青蒿素也可诱发耐药性，但较氯喹为慢。与周效磺胺或乙胺嘧啶合 用，可延缓耐药性。青蒿素治疗疟疾的缺点是复发率高，口服给药时，近期复发率可达30%，这与其在体内消除快、代谢物无抗疟活性有关，但与伯氨喹合 用，可使复发率降至10%左右。

临床应用 本品用于间日疟、恶性疟，特别是适用于氯喹耐药虫株的感染和脑型恶性疟的治疗。

不良反应 不良反应较少见，偶有恶心、呕吐、四肢麻木、心动过速，停药后立即消失。动物实验中应用大剂量时，曾发现骨髓抑制、肝损害作用、胚胎毒性。

☆ ☆☆☆考点3：奎宁

药动学 口服迅速吸收，分布于肝肾中。大部分在肝中被氧化分解后失效。奎宁及其代谢产物经肾迅速排泄，24h后几乎全部消失。

抗疟作用 抗疟作用与氯喹相似，但效力较弱而毒性大，对各种疟原虫的红细胞内期裂殖体均有杀灭作用。奎宁在肝内迅速氧化失活，由肾排出，因 此奎宁体内消除快，作用时间短，易复发。对红细胞外期裂殖体无效，对配子体也无明显作用。奎宁还有微弱的解热镇痛作用及抑制心肌和兴奋子宫的作用。

临床应用 主要用于耐氯喹或耐多药的恶性疟，尤其严重的脑型疟

不良反应 奎宁不良反应较多。常见的有金鸡纳反应，如恶心、呕吐、耳鸣、头痛、听力和视力减弱，甚至产生暂时性耳聋。因金鸡纳树的其他生物 碱也有此反应，故称为金鸡纳反应。有心肌抑制作用，奎宁降低心肌收缩力，减慢传导和延长心肌不应期，静脉注射时可致血压下降和致死性心律失常。可发生特异 质反应，少数恶性疟患者即使应用很小剂量也会发生急性溶血（又称黑尿热），严重者可致死。奎宁对妊娠子宫有兴奋作用，故孕妇忌用。

☆ ☆☆☆考点4：乙胺嘧啶

药动学 口服吸收缓慢而完全，4h血药浓度达高峰。主要分布于肝、肾、脾、肺等组织。代谢产物经肾缓慢排泄，t1/2约为90h.一次服用，有效血药浓度可维持2周。

抗疟作用 乙胺嘧啶能杀灭各种疟原虫红细胞外期速发型子孢子发育，繁殖而成为裂殖体。对红细胞内期的未成熟裂殖体也有抑制作用，但对已成熟 裂殖体则无效。在用药后第二个无性增殖期才能发挥作用，故起效缓慢。乙胺嘧啶虽不能直接杀灭配子体，但按蚊吸入含此药血液时，可使蚊体内的配子体失去孢子 增殖能力，起阻断传播的作用。每周服药1次，可以起到病因性预防作用。

乙胺嘧啶对疟原虫的二氢叶酸还原酶有较大的亲和力，可抑制其活性，使二氢叶酸不能转变成四氢叶酸，从而使核酸合成受阻，疟原虫的生长繁殖受到抑 制。若与磺胺类半衰期相近的周效磺胺或氨苯砜（抑制二氢叶酸合成酶）合用，将对叶酸合成代谢发挥双重阻断作用，可获得协同效果，减少耐药性的产生。

临床应用 目前主要用于病因性预防。

不良反应 治疗量基本上不发生不良反应。但长期大剂量用，会干扰人体叶酸代谢，引起造血功能障碍及消化道症状，严重的可致巨幼红细胞性贫血 或白细胞减少症。应定期检查血象，出现异常应及时停药，必要时给予甲酰四氢叶酸以改善造血功能。因其略带甜味，易被儿童误服而中毒，表现恶心、呕吐、发 热、发绀、惊厥，甚至死亡。

禁忌证 动物实验有致畸作用，孕妇禁用。

☆ ☆☆☆☆考点5：伯氨喹

药动学 口服在肠道内吸收迅速、完全，2h血药浓度达峰值。主要分布于肝、肺、心、脑等脏器。肝内浓度，此利于杀灭肝内疟原虫，t1/2为6～8h.主要在肝内代谢，服药后24h大部分以代谢产物的形式经尿排泄，原形药仅占1%左右。

抗疟作用 伯氨喹对间日疟红细胞外期迟发型子孢子（或休眠子）和各疟原虫的配子体都有较强的杀灭作用，是有效控制良性疟复发和中断各型疟疾传播的药物。对红细胞内期裂殖体作用较弱，故不能控制临床症状，对恶性疟红细胞内期裂殖体则完全无效。

伯氨喹在体内转化成的喹啉二醌，其结构与辅酶Q类似，能拮抗辅酶Q的作用，阻断疟原虫线粒体内的电子传递，从而抑制疟原虫的氧化磷酸化过程，线粒体肿胀缺损，杀灭休眠子和各型疟原虫的配子体。

临床应用 用于根治良性疟和阻断各型疟疾的传播。可与氯喹合用，提高疗效，减少耐药株的产生。

不良反应 本药治疗量毒性较小，可引起疲倦、头昏、恶心、呕吐和腹泻，甚至少数人出现药热、粒细胞减少等，停药后消失。

严重的反应为少数特异质患者发生的溶血性贫血和高铁血红蛋白血症。少数遗传缺陷的患者，红细胞内缺乏葡萄糖-6-磷酸（P-6-D），不能将氢传 递给辅酶Ⅱ（NADP）和谷胱甘肽，从而失去保护红细胞膜和血红蛋白的作用。缺乏者服用伯氨喹，伯氨喹的氧化代谢产物引起氧化应激反应，产生高铁血红蛋白 自由基和过氧化物及氧化型谷胱甘肽（GSSG），前者不能迅速补充NADPH，不能保护红细胞膜，致急性溶血性贫血，出现寒战、高热、黄疸、尿闭等，后者 使高铁血红蛋白不易还原成血红蛋白，而导致高铁血红蛋白血症，出现发绀、胸闷、缺氧等症状。

禁忌证 有粒细胞缺乏症倾向的急性病人（如活动性风湿性关节炎）禁用本品，有蚕豆病史或家族史亦禁用。

自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。 这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。

在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上， 自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。 此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。

自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等

1、自噬相关试剂的使用。

①MDC: 取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;

②Rapamycin: 用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;

400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;

③3-MA: 首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；

用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些

⑤无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。

⑥Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。

1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；

2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。

2、自噬诱导剂

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

(5) Rapamycin：mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

3、自噬抑制剂

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂

(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）

衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。

氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;

4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡

单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:

(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;

(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1 nM的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;

(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;

(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。

5、流式细胞术检测细胞自噬发生率

(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;

(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;

(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000 rpm.离心5 min;

(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;

(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5 min;

(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;

(10)重复步骤(6)和(7);

(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞

仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。

LC3B WB: 1:2000

条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA 湿转45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可

LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min

转自科研者言公众号

基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用