由胚乳培养获得的植株，是否一定要进行染色体倍数的检查？为什么

玉米在全世界范围广泛种植，是仅次于小麦和水稻的第三大粮食作物，同时也是粮食作物中用途最广、可开发产品最多、用量最大的工业原料。随着人口的增加和经济的发展，玉米的需求量不断上涨。耕地面积减少和环境的恶化使人们对高产、优质、抗逆性强的玉米新品种需求日益迫切。而目前用常规育种方法获得高配合力的纯合自交系，常需耗费大量的人力和时间，加以连续多年的人工自交与选择，获得一个纯系平均需要4-6年的时间[1]。常规的育种技术已经越来越不能满足人们的育种需求。近年来，单倍体育种技术、基因工程育种、分子标记辅助育种等生物技术手段的发展提高了育种效率，开辟了玉米育种的新途径。

加快自交系的选育和纯化历来是玉米育种工作的主要内容和基础。采用单倍体育种技术选育自交系可使材料的纯化从常规育种的5-7年缩短到1-2年，大大提高了育种效率。从我国育种现状看，单倍体育种技术已经成自交系选育的重要手段，并在生产实践中得到广泛应用。

近年来，随着人们对单倍体育种的深入研究和科技的进步，逐渐形成的单倍体育种的育种思路：①诱导获得单倍体；②单倍体水平的选育；③多倍体的重新合成[2]。其中，单倍体的获得和单倍体的二倍化是玉米单倍体育种的关键过程。

玉米单倍体育种技术主要步骤有：1）自然发生的单倍体、孤雌生殖、花药（花粉）培养、远缘杂交单亲染色体消失、延迟授粉诱导、辐射诱导以及利用利用单倍体启动基因等技术和途径获得单倍体；2）在获得玉米单倍体以后，需要进行单倍体鉴定确认，主要的方法有：形态解剖学方法、细胞遗传学方法、射线照射法、分子标记法等；3)获得的单倍体是无法直接进行育种利用的，必须进行染色体加倍，使之成为能够利用的二倍体纯系，加倍的途径主要有两个，一是自然加倍，正常花粉粒很少，单倍体自然加倍的频率仅占全部单倍体植株的10％；人工加倍目前主要是利用秋水仙素处理，处理单倍体的根尖或茎尖生长点，能够获得较好的加倍效果。

1 单倍体的获得

玉米自然发生单倍体的频率是0.05％-0.1％。主要是母本单倍体(孤雌生殖)，孤雄生殖单倍体很罕见，其发生的频率为十万分之一。所以，自然界中存在的单倍体极少，人们主要采用人工诱变的方式获得所需要的单倍体。

1.1 人工诱变单倍体

1.1.1 孤雌生殖

诱导玉米孤雌生殖的方法很多：利用异种花粉授粉，刺激未受精卵发育引起孤雌生殖产生单倍体；利用紫外线或X射线处理的玉米成熟花粉粒给正常植株授粉，让已无授精能力的花粉去刺激未受精的卵细胞单性发育成单倍体的胚；利用甲苯胺蓝（TB）等化学药剂处理花粉产生单倍体。化学药物诱导孤雌生殖常易产生一些影响生理生化和形态上的畸变，其可靠性常受到怀疑[3,4]。

1.1.2 花药（花粉）培养

用花粉(小孢子)培养技术获得单倍体在许多植物上都已取得成功。在获得单倍体的同时，还常常出现已自然加倍了的二倍体和双倍体。这个方法的缺点是：要经过组织培养的过程，先诱导愈伤组织，再分化形成再生植株，但并非每个小孢子都能无性增殖。此外，二倍体化以后，因适应性问题而出现生长或结实的困难。花培育种效率不高、绿苗诱导率低、染色体加倍的困难等也是原因。从理论上说，玉米花药培养是快速获得玉米纯系的有效途径。但至今通过玉米花药培养获得花培纯系和杂交种很少有大面积应用于生产[5]。目前国内外研究表明，一般愈伤组织诱导率可达2%的水平，绿苗率达到2%的水平。

1.1.3 远缘杂交单亲染色体消失

在远缘杂交中，可能由于双亲体细胞分裂周期的不同步，导致某一亲本染色体的丢失，从而引起单倍体的发生。

1.1.4 延迟授粉诱导

延迟授粉，花粉管即使到达胚囊内，卵细胞由于丧失受精能力而不能受精，但其受花粉管刺激后容易引起分裂，从而进行孤雌生殖形成单倍体植株。去雄后延迟授粉可以大大提高孤雌生殖的诱导率[6]。其原因可能是授粉促进胚乳的形成，从而保证孤雌生殖幼胚的顺利发育。

1.1.5 辐射诱导

用射线照射花或父本花粉经X射线处理后，给去雄的母本授粉，以影响授精，诱导单性生殖产生单倍体。

1.1.6 利用单倍体启动基因

1950年美国的North rup King种子公司发现了一个高频诱导单倍体的材料。EdCoe(1956)发现这份材料有利用的价值，并导入了控制子粒性状和植株性状的两种显性标记基因(R-nj、P1)，又经过两次回交和两次自交，然后定名为Stock6。在育种实践中用Stock6作父本，被诱导的育种试材作母本，大约有3％的单倍体胚[7]。Hagberg(1980)在大麦中鉴定出一个部分显性的单倍体启动基因(hap)突变体，它控制异常胚、胚乳的败育或存活，其纯合的后代能产生10％～15％的单倍体。刘纪麟(2001)从美国引进了玉米诱导系Stock6，并用它作父本对WBM、辽旅等6个玉米群体进行了单倍体诱导，经对诱导后代的子粒、成株标记和植株育性的鉴定，已获得一些双单倍体材料。

2 单倍体水平的选育—单倍体的鉴定

单倍体的鉴定方法主要有形态学鉴定法、解剖学鉴定法、细胞遗传学鉴定法、射线照射法、遗传标记法、分子标记法等。在玉米诱导产生单倍体的鉴定上主要利用形态学鉴定法和遗传标记法。

2.1 形态学和解剖学鉴定法

利用形态学和解剖学特征来鉴定单倍体是一种直观和便捷的方法。玉米单倍体细胞染色质的量仅为二倍体细胞质的一半，因而它的细胞及细胞核变小，在解剖学上观察叶片表皮气孔、保卫细胞的大小和数目，也可以区分单倍体和二倍体。由于细胞变小导致营养器官和繁殖器官变化及植株矮化，在幼苗期可以用目测选出大部分的单倍体。单倍体在正常生长状态下常常比它的标准类型小的多；在幼苗生长的早期阶段主根和牙鞘的长短区别明显；在苗期玉米单倍体的第一片叶较短;比较胚和盾片的大小也能对单倍体做出初步的鉴定。玉米单倍体的成株约为基因型相同的纯合二倍体姊妹株高度的70%，叶面积约为后者的35%。此外，单倍体植物的特点是：开花较早，延续时间长；花不正常、败育，结的果实少；单倍体植株矮小，叶片、花、花药、气孔均较小，花序较紧密、花较多，花丝短，其相应的二倍体则相反[8]。

2.2 细胞遗传学鉴定法

最准确的方法是用根尖分生组织压片观察体细胞中或减数分裂细胞中的染色体数目，可区分整倍单倍体和非整倍单倍体。利用光度计法分析细胞核中DNA含量，但不能区分整倍单倍体和非整倍单倍体，又由于该法检测速度慢和需要仪器设备，不适合在田间进行大批量地鉴定。

2.3 射线照射法

植物对辐射的敏感性随着倍数性的变化而变化，是生物学的一般规律。基本方法是用电离射线照射(如X射线)叶片的一部分，先看到褪绿，而后出现辐射坏死。关键是要探索出不同作物的最适剂量和照射时间，如果掌握的好，该法可成为最简便和实用的鉴定方法之一。

2.4 遗传标记法

利用遗传标记筛选单倍体，可减少根据形态上差异筛选时常有的误差。因此利用遗传标记成为最可靠有效的单倍体鉴定方法。在玉米中，著名的Navajo标记基因R-nj是利用较成功的。Coe的Stock6和宋同明等的高诱1号单倍体诱导系，导入了子粒和植株显色的遗传标记基因，农大高诱1号诱导率高，繁殖容易，克服了Stock6的重要缺陷，杂交当代可使母本子粒的胚面增大，标记较为清晰。

由单倍体诱导系诱导出的子粒分三种类型：胚乳糊粉层呈现紫色或紫红色，胚芽部位也呈现紫色或紫红色；胚乳糊粉层呈现紫色或紫红色标记.，胚芽部位无色；胚乳糊粉层和胚芽部位均不显色无标记[2]。

2.5 分子标记方法

汤飞宇等(2004)利用SSR标记检测来源于玉米孤雌生殖的双单倍体，取得明显的效果[9]。

3 多倍体的重新合成

染色体加倍可以自然发生，其发生频率可以通过选择加强。此外，人工诱导加倍的方法也得到发展。

3.1自然加倍

绝大部分单倍体的雄花是高度不育的。但在少数情况下．单倍体的雄穗会自然发生全部或局部二倍化，从而能够产生正常花粉。有证据表明一个单倍体植株的一小部分体细胞在一般情况下单倍体植株表现为雌雄不调，正常花粉粒很少，所以单倍体自然加倍的频率仅占全部单倍体植株的1%。许多材料的自然加倍率低于5%，也有的材料不发生自然加倍。仅仅依靠单倍体的自然加倍难以满足育种实践的要求，必需对其进行人工加倍。

3.2人工加倍

通常雄穗育性的自然恢复率都未超过20％，因此，用化学处理方法来加倍染色体数尤为必要。一般来说，使用0.06％～0.5％的秋水仙素溶液来处理单倍体幼苗可将单倍体雄穗的加倍频率提高到20％～50％。Kato(2002)利用一氧化二氮气体加倍单倍体，分别获得4个自交系和杂交种[10]。

自然加倍特性可以通过再选择来提高，使用2个DH系作为亲本材料，进行下一轮选系可提高新选单倍体雄穗的自然加倍频率，育性恢复率从9.4％提高到33％，甚至达到43％。

4 单倍体育种的发展前景

单倍体技术在玉米育种中的应用前景是十分诱人，在玉米育种上应用具有如下优点：快速获得纯系；在单倍体中能简化基因互作，去掉超显性效应，保留有利的加性和加性上位效应；还可淘汰有害的、致死和半致死的隐性基因。但是，单倍体育种技术也存在缺点：不能有效打破不良基因的连锁；基因间的重组几率较低；单倍体的诱导频率不高。此外，重组二倍体时染色体加倍具有一定的困难。目前，二倍体化的频率能达到15％－25％。另外，目前单倍体在有些国家已在玉米育种中应用了，一些高频诱导系已被申请了专利，限制了国际间材料的交流。我国要在玉米育种中利用这一技术，就必须创造自己的单倍体诱导系。

单倍体育种与种质扩增和育种材料的改良有机结合起来，先对目标诱导材料进行有效的重组改良，累积足够的有利基因位点，然后再用单倍体技术获得纯系，将会极大地发挥单倍体育种的优势，大大提高育种效率，并且双单倍体群体在遗传学研究上具有重要的研究价值，可应用于遗传图谱的构建、基因定位及克隆[2]。未来的工作除了要进一步完善单倍体诱导体系、提高单倍体诱导率外，还应该着重研究单倍体加倍技术。杜娟等(1999)利用有性杂交使有利基因型重组后进行花药培养从而快速获得玉米纯系[11]，建立了玉米单倍体育种的新体系，不仅具有理论意义，还存在着巨大的生产潜力。

参考文献

1.Kuo C S，Guo Z C，Gui Y。Anther culture and haploid breeding of maize in China[J]。In：Y P S Bajaj（ED），Biotechnology in Agriculture and Forestry，1994，Vol 25：Maize，Spinger-verlag，Berlin，149-161

2.梁文科，戚廷香，徐尚忠。单倍体技术在玉米育种中的应用和新进展[J]。玉米科学，2004，12（3）：13-15，18）

3.刘志增，宋同明。玉米杂交诱导孤雌生殖单倍体研究进展[J]。玉米科学，1999，7（2）：16-19

4.石太渊。药物诱导玉米孤雌生殖的研究[J]。杂粮作物，2000，20(1)：17-20

5.郭奕明，杨映根，郭仲璨。玉米花药培养和单倍体育种的研究新进展[J]。植物学通报，2001，18（1）：23-30

6.姜昱，王玉民，王中伟，等。我国玉米单倍体育种技术研究进展[J]。玉米科学，2008，16(6)：48-57

7.韩学莉，唐祈林，曹墨菊，等。用Stock6杂交诱导的单倍体鉴定方法初探[J]。玉米科学，2006，14（1）：64-66

8.赵延明，董树亭，张锁良，等。玉米单倍体育种技术研究与应用进展[J]。玉米科学，2007，15（5）：60-64

9.汤飞宇，王菲，王国英。利用SSR标记检测来源于玉米孤雌生殖的双倍体[J]。江西农业大学学报，2004，26（6）：859-862

10.才卓，徐国良，CHANGMING-TANG，等。玉米单倍体育种研究进展[J]。玉米科学，2008，16（1）：1-5

11.杜娟，母秋华，贾玉峰，等。利用桥接组合的转育方法提高玉米花药培养诱导率的研究[J]。玉米科学，1999，7(3)：16-18

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