对黄瓜细胞遗传学和分子生物学的研究有哪些？

（一）黄瓜的细胞遗传学研究

戚春章等（1983）通过对西双版纳黄瓜的染色体数、与普通黄瓜杂交的可育性、一代杂种的表现和过氧化物酶酯酶同功酶的观察和鉴定，证明了西双版纳黄瓜是黄瓜的一个变种。

利容千（1989）的研究表明，西双版纳黄瓜的染色体数目与黄瓜相同，但染色体的绝对长度小于黄瓜，染色体长度比、核型类别与黄瓜有较大差异，而且未显示出Giemsa带。

Ramachandrau等（1985）在分析黄瓜野生种和栽培种有丝分裂时期染色体C-带时，发现其基因组上异染色质较为丰富。同时，野生种的异染色质远远高于栽培种，他们认为这种在栽培种中异染色质的减少与驯化有关。

Hoshi等（1998）对二倍体和四倍体黄瓜染色体的分析发现，其体细胞染色体数分别为2n=14和28。单倍体染色体由5条等臂染色体和2条亚中间着丝粒染色体组成。所有染色体均有清晰可见的C带。单倍体具有C带染色体的长度占染色体总长度的44.9%。染色体1、2、4、5和7具有稳定的C带。3条粗大的C带位于染色体1和2的最接近区域。染色体1上的C带长度占短臂长度的68.4%。染色体2上的C带位于着丝粒附近，占该染色体全长的57.6%，在早中期有伸长的主缢痕。在前中期，染色体2的长臂和短臂完全分离。在中期细胞中，不能观察次缢痕的数量。但是，在单倍体植株中，6条染色体似乎有次缢痕。在2条大染色体的主缢痕处可以观察到两条银染带。

陈劲枫等（2003）认为野黄瓜Cucumis hystrix（2n=24）是在亚洲发现的第一个染色体基数为12的黄瓜属物种。这一发现对现行的以染色体基数和地理分布为基础的黄瓜属分类系统提出了质疑。

曹清河等（2004）以南方型和北方型两个生态型黄瓜为材料，用改良的染色和制片方法，较为系统地研究了黄瓜花粉母细胞（PMC）减数分裂及其雄配子体的发育过程。结果表明：黄瓜减数分裂属于同时型胞质分裂，双线期染色体具有明显的交叉节并呈现出较易识别的棒状或环状形态，在末期Ⅰ和末期Ⅱ有多核仁和核仁融合现象；在四分体时期的小孢子成十字交叉形（decussate type），而非四边形（isobilateral type）；雄配子体发育过程中观察到两核居中期的特殊现象，在核居中期小孢子只有一层壁，而在核靠边期小孢子出现了两层壁；黄瓜的成熟花粉粒属于两核花粉粒。

（二）黄瓜分子水平的遗传多样性与分类研究

20世纪90年代中期前，关于黄瓜的分子遗传多样性分析主要以同工酶标记为主。但标记数量只有18个，且多态性很低，不能区分黄瓜各栽培品种。其后RFLP、AFLP、SSR等DNA标记技术陆续在黄瓜上开始应用。

Esquinas-Alcazar（1977）、Staub等（1985c）都曾分别利用同工酶研究黄瓜的亲缘关系。尽管黄瓜同功酶的遗传变异较小，但Knerr等（1989）用代表74个生化位点的40种酶对美国收集保存的757份来源于45个国家的黄瓜种质的遗传多样性进行了评价，在18个位点观察到了多态性。Meglic等（1996a，1996b），Staub等（1997，1999）先后对美国国家种质库保存的黄瓜资源和后来从印度和中国收集或引入的资源进行了21个同功酶位点的多态性的比较分析，在明确不同来源黄瓜种质资源的特点和关系的同时，认为印度和中国的黄瓜种质互不相同，而且也不同于其他来源的黄瓜种质，中国和印度的黄瓜种质资源代表了美国黄瓜收集品中最多样的遗传变异。

Dijkhuizen等（1996）利用RFLP标记评价两组黄瓜种质的遗传多样性。在第一组16个品系中，RFLP标记反映了与同工酶分析一致的品种间的亲缘关系；在第二组35个栽培品种中，RFLP分析揭示了与形态（果形）及实际系谱关系相一致的品种间的亲缘关系，认为RFLP可用于黄瓜分类和遗传多样性分析。

张海英等（1998）对34份分别来自美国、日本、英国和中国的黄瓜材料作了遗传亲缘关系的RAPD分析。从200个10碱基的随机引物中筛选出20个用于PCR反应，共获得130条扩增带，其中51条表现多态性；每个生态型品种都具有其特有的扩增（或缺失）条带以区别于其他生态型品种，聚类分析成功地将供试材料分为三类：类群Ⅰ为华北类型；类群Ⅱ为华南类型与欧洲露地型；类群Ⅲ为欧洲温室型。其分析结果显示：黄瓜基因组中有大量相同的DNA序列，是一种遗传变异幅度较小的植物；尽管如此，RAPD技术仍然能够成功的对其进行聚类分析，验证了RAPD对黄瓜聚类的可能性，同时认为一些引物所产生的特有缺失和特异条带可作为某些类型的特异条带。

李锡香等（2004）利用29个引物对66份来源和类型不同的黄瓜种质基因组DNA的RAPD分析，共扩增出了253条带，其中195条为多态性带，比例为77.08%。不同引物所揭示的种质多样性差异很大。供试种质间平均期望杂合度为0.388。中国黄瓜种质的平均期望杂合度为0.348，略高于国外引进种质。长江以南黄瓜种质的遗传多样性高于长江以北，华南型种质的遗传多样性高于华北型种质。长江流域以南可能是黄瓜的较早或主要的演化地。供试种质依RAPD标记被分为8个组群。西双版纳黄瓜明显地与其他栽培种质分开了，国外引入的绝大多数种质被聚到一起或分属单独组群。除西双版纳黄瓜外，其他中国黄瓜栽培种质的遗传关系与形态特征和地域分布虽然存在一定的相关性，但不总是一致，表明地区间的引种交流可能导致了某些基因在不同种质间的渗入。

Horejsi和Staub（1999）对180个黄瓜材料进行RAPD分析，得到的遗传距离在0.01～0.58之间，认为黄瓜的遗传背景较窄。RAPD的聚类结果与RFLP的相似，同时，获得的71个多态性位点可把每个品种都区分开来，证明RAPD方法对黄瓜遗传多样性的分析和区分黄瓜不同的基因型是有效的。

庄飞云等（2003）从220个随机引物中筛选出31个对23份黄瓜属材料，包括黄瓜栽培种、黄瓜野生变种、近缘野生种、种间杂交种及其与黄瓜回交自交的后代以及甜瓜进行亲缘关系的分析。以遗传距离0.37为阈值，23份材料被聚类为黄瓜栽培种、近缘野生种、种间杂交种和甜瓜亚属种4类。RAPD的分析结果表明，野生种C.hystrix与黄瓜栽培种的遗传距离近于甜瓜，该结果与同工酶分析结果一致。

Truksa（1996）的研究证明RAPD的低多态性难以在验证杂交种子的杂交性上发挥作用。

Katzer等（1996）用SSR研究了不同葫芦科蔬菜品系的多态性，7个SSR中的4个可检测出11个黄瓜品系的多态性。证实了SSR在黄瓜中存在多态性。Danin-Poleg（2000）使用来自甜瓜的48个和来自黄瓜的13个共计61个SSR对甜瓜和黄瓜进行遗传多样性的研究，其中53个显示多态性。利用其中的40个SSR（30个来自甜瓜，10个来自黄瓜）对11个供试黄瓜品种进行多态性分析，26个SSR扩增出产物（10个黄瓜SSR，16个甜瓜SSR），其中19个SSR（8个黄瓜SSR，11个甜瓜SSR）显示良好的多态性。11个黄瓜供试品种被明显聚类为栽培黄瓜和野生黄瓜两类（遗传距离0.999）。而10个栽培黄瓜品种内聚类距离小于0.306，未能显示足够的多态性，因此进行黄瓜栽培品种内的遗传多态性分析还需结合其他分子标记及更多的SSR标记。

陈劲枫等（2002）通过RAPD标记分析表明，在所选的21个随机引物中，15个引物（占71%）显示出栽培黄瓜（Cucumis sativus L.，2n=14）与酸黄瓜（C.hystrix Chakr.，2n=24）正反交之间的差异；其中一些条带表现出父性遗传现象。陈劲枫等（2003）采用SSR和RAPD两种分子标记对黄瓜属22份不同类型材料的亲缘关系进行了研究。结果表明，野黄瓜C.hystrix与黄瓜C.sativus var.sativus（2n=14）间的遗传距离（SSR：0.59，RAPD：0.57）小于其与甜瓜C.melo var.melo（2n=24）间的距离（SSR：0.87，RAPD：0.70）。SSR计算的各物种间遗传距离值高于RAPD的结果，线性方程为y=0.859x+0.141，但两者相关性较好，r=0.94。综合109个SSR位点和398个RAPD条带对22份材料进行聚类分析，共分为两群：CS群（黄瓜、西南野黄瓜C.sativus var.hardwickii、C.hytivus及野黄瓜C.hystrix）和CM群（甜瓜、菜瓜C.melo var.conomon、野生小甜瓜C.melo ssp.agrestis及非洲角黄瓜C.metuliferus）。

顾兴芳等（2000）对AFLP技术在黄瓜种质资源鉴定及分类上的应用进行了初步的探索。分析了国内外的15份品种，将它们分为两大类群和一个特殊类型：华北类型、欧美露地型和一个特殊的以色列Kessem品种。AFLP在黄瓜上显示的多态性高于RAPD。

李锡香等（2004）采用AFLP分子标记技术，对中国黄瓜种质资源遗传多样性及其与外来种质的关系进行了分析，结果表明，8对AFLP引物在70份黄瓜种质中共扩增出425条带，多态性带的比例为66%。供试黄瓜种质的平均期望杂合度为0.376，中国种质的平均期望杂合度为0.387，明显高于国外种质的0.291。西双版纳黄瓜和印度野生黄瓜具有一些栽培种质没有的特异位点，中国栽培种质的特异位点多于外来栽培种质，后者也有一些中国栽培种质没有的特异位点。聚类分析将70份种质分为三大组群，即西双版纳黄瓜（Cucumis sativus L.var.xishuangbannanesis Qi et Yuan）组群，C.sativus var.hardwickii野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。西双版纳黄瓜与栽培黄瓜的距离最远，与野生黄瓜次之。按一定的遗传距离可以将中国和外来栽培种质分开。大多数华南型和华北型种质归属于不同的亚组。这些结果有助于有目的地利用这些变异拓宽育种材料的遗传背景。

各种分子标记在栽培黄瓜上显示的多态性较低。如RFLP的多态性标记比率为33%（Dijkhuizen等，1996）。RAPD的多态率为64%（Kennerd等，1994）。说明黄瓜栽培品种的遗传基础比较狭窄。野生黄瓜则具有栽培黄瓜所没有的性状和位点，在育种中具有较高的利用价值（李锡香，2002）。

（三）黄瓜连锁图谱的构建

Pierce等（1990）对自20世纪30年代以来发现的黄瓜已知性状的基因进行了总结和分类，并根据相关文献数据又构建了一张含有42个黄瓜标记性状、6个连锁群的经典遗传连锁图。显然6个连锁群并没有与黄瓜染色体一一对应，其中连锁群Ⅰ最大，有12个基因；而连锁群Ⅳ最小，只有2个基因。还有一些基因没有被定位在这些连锁群中。该图谱来自之前的基因连锁研究数据分析整合，由于基因定位所依据的群体无法确定，使得图谱的精确度降低，一些基因位点的间距以及图谱总长度无法确定。

Ramachandran等（1986）研究认为：黄瓜在减数分裂过程中每对染色体将有2.12次交换，每次交换约占基因组长度50cM，黄瓜基因组长度大约为742cM（2.12交换/对染色体×7对染色体×50cM/交换）。Staub（1993）认为黄瓜的基因组长度是750～1000cM，因此一个饱和的黄瓜连锁图谱应包含至少1000个左右的标记。

研究者们先后利用各种标记，构建了多张黄瓜遗传图谱，Lee等（1995）利用RAPD在黄瓜的杂交F2群体中发展分子标记，获得具有28个RAPD标记的黄瓜分子连锁图谱。

Fanourakis等（1987）利用F2和形态学标记构建了4个连锁群，图谱长度为168cM，涉及13个形态标记，标记间平均间距12.9cM。Vakalounakis（1992）发现了一个隐性叶型突变基因，并与其他的表型标记进行连锁分析，构建了具4个连锁群的遗传图谱，涉及11个标记，覆盖基因组长度95cM。Knerr等（1992）利用同工酶标记构建的图谱长度为166cM，由18个同工酶标记组成，相互连锁组成4个连锁群。Kennard等（1994）利用分子标记（RAPD、RFL P）、同工酶、抗病性和形态学标记在一个遗传背景宽和窄的群体中构建的图谱长度分别为766cM和480cM，前者有58个位点，分属10个连锁群，该图谱标记间平均距离约为21cM。后来，Meglic等（1996c）又利用同工酶和形态学标记构建的图谱长度为584cM，将同工酶的标记增加到21个。Serquen等（1997）以栽培品种间杂交后代群体，使用1520个RAPD引物和形态学标记进行了连锁图谱的构建，共产生180条多态性带，73个引物标记出80个位点。在构建的9个连锁群中有77个RAPD标记、3个农艺性状（F，de和ll）。标记间平均距离为8.4±9.4cM，覆盖了600cM。Staub等（2000）利用JoinMap v 110软件，将前6张黄瓜遗传图谱进行了图谱整合研究，最后整合成一个具有134个位点的连锁图谱，图谱长度431cM，两个标记间平均间隔3.2cM。随着RAPD，RFLP，SSR，AFLP等DNA标记的出现和使用，Staub实验室构建的黄瓜标记连锁图谱有了很大发展。该小组完成的Park图谱所定位的RFLP，RAPD，AFLP的标记总数达到353个，覆盖了815.8cM的黄瓜基因组。与Kenard图谱相比，某些相同标记在两图谱上的位置存在差异（Park等，2000）。与Staub实验室合作完成的Danin-Poleg图谱在Kenard图谱基础上新增14个SSR标记、39个RAPD和同工酶标记，定位标记121，其中RFLP标记62个、RAPD标记36个、SSR标记14个、同工酶标记5个及形态和抗性性状4个，覆盖基因组长度780.2cM，标记平均间距6.4cM（Danin-Poleg等，2000）。Bradeen等（2001）公布的最新连锁图谱由于AFLP标记的使用使得标记间的平均连锁距离缩短到2.1cM。

李效尊等（2004）利用侧枝长势强、全雌性、欧洲温室型黄瓜自交系S06和侧枝长势极弱、强雄性自交系S52的栽培品种间杂交F2代群体，构建了黄瓜的随机扩增多态性DNA（RAPD）分子遗传框架图谱，并定位了侧枝性状基因（lb）和全雌基因（f）。图谱中共包括79个RAPD标记，分属9个连锁群，总长度1110.0cM，平均间距为13.7cM。侧枝基因（lb）定位在一个大的连锁群上，其两侧标记是OP2Q521和OP2M2222，与lb的间距分别是9.3cM和15.9cM。全雌性基因（f）定位在一个小的连锁群上，其两侧标记是OP2Q522和BC151，与f的间距分别是13.8cM和13.6cM。

张海英等（2004a）以黄瓜栽培品种的重组自交系为材料，采用AFLP、SSR、RAPD分子标记，构建了包含9个连锁组群，由234个标记组成的连锁图谱，其中包括141个AFLP标记、4个SSR标记和89个RAPD标记，覆盖基因组727.5cM，平均图距3.1cM。至此，构建的遗传图谱长度为166～1110.0cM，平均标记间隔为3.1～1.37cM。

目前已经发表的黄瓜各类形态学基因总数已经达到132个（Wehner，1997；Xie等，2001），在图谱中被定位的基因有52个，与重要经济性状紧密连锁的标记尚少（张海英等，2004a）。

目前被标记的园艺性状基因有雌性系（F）、有限生长（de）、小叶片（ll）。被进行QTL分析的园艺性状包括性别表达、主干长度、侧蔓数量、花期、果数和果重、瓜长和瓜径、瓜长/瓜径的比值。

陈劲枫等（2003）利用RAPD技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用300个10碱基的随机引物，按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增，筛选出5个在全雌和弱雌株基因池（gene pool）中表现多态性的引物。单株检测表明，引物B11具有全雌特异性，在检测的大多数全雌性单株中均可扩增出一条约1000bp的特征带。而在雌雄同株的单株中则未见。因此，将该全雌性特异的片段命名为B1121000。该标记的获得为黄瓜性别特异基因的分离和克隆奠定了基础。另外，以ACC合酶基因（CS2ACS1）特异引物检测分离群体单株，发现该酶基因存在于所有性型的单株中，不具有性别特异性。娄群峰等（2005）以F2性型分离群体为材料，利用BSA法和AFLP引物EcoRI-TG+MseI-CAC筛选出了一条分子量为234bp的特异带，该标记与全雌性位点的连锁距离为6.7cM。

张海英等（2004b）以叶面积增长量为鉴定指标，对黄瓜耐弱光性状进行了研究。在234个分子标记位点组成定位了5个叶面积增长量的QTL，每个QTL的贡献量在7.3%～20.2%之间，其中1个QTL显示正效加性效应，4个QTL显示负效加性效应。

Serquen等（1997）对黄瓜园艺性状进行了QTL分析。发现标记BC-551和BC-592与ll位点分别相距3.4和12.2cM；OP-L18-2与de相距16cM。在两个试验点鉴定出了5个与性别有关的QTLs，效应最大的QTL位于B连锁群上，与F位点相连，解释了该性状变异的67.5%。5个控制主茎长度的QTLs中，效应最大的QTL位于B连锁群上，解释了表型变异的39%～45%。3个与单株分枝数有关的QTLs中，1个两试验点共有的QTL位于B连锁群上，解释了表型变异的40%和37%。控制开花天数的3个QTL均位于B连锁群上，单个位点最大表型效应为12.9%。控制果数的4个QTL的单个位点最大效应为19.8%。与果重有关的4个QTL的单个位点解释的最大表型方差为39.7%。控制果长的1个QTL解释的表型方差为21.4%～31.0%。与果径有关的4个QTL中效应最大的QTL解释的表型方差为21.9%。

Serquen（1997）使用RAPD技术对黄瓜进行了园艺性状的QTL分析。在5个与性别表达有关的QTL中，贡献最大的一个QTL在连锁群B中与F位点相连[Serquen 和Staub（1997）]。

被研究的抗病基因有番木瓜环斑病毒西瓜小种（PRSV-W）的抗性基因（Prsv-2）、小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）的抗性基因（zym）和霜霉病的抗性基因（dm）。

Park（2000）对Prsv-2和zym两种抗性位点（分别抗PRSV-W和ZYMV）进行标记筛选，发现Prsv-2和zym相距2.2cM，找到了一个与zym共分离的AFLP标记，E15/M47-F-197；另有3个AFLP与zym以5.2cM连锁。标记dm的研究比较多见，但是，大多距离较远。在Horejsi（2000）所筛选到的几个RAPD标记中，BC519连锁最紧密，遗传距离是9.9cM；而Kennard（1994）也曾获得过一个连锁距离为9.5cM的RFLP标记。

张桂华等（2004）利用F2群体和BSA法，通过P18M47引物获得了与黄瓜抗白粉病基因紧密连锁（5.56cM）的两个特异片断238bp/236bp。

花椰菜种质资源的创新是怎样的？

文章名称：Impacts of allopolyploidization and structural variation on intraspecific diversification inBrassica rapa

发表时间：2021年5月

发表单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所等

发表期刊：Genome Biology

影响因子：10.8

一、研究背景

白菜（AA, 2n=20）是主要的经济作物，它是芸薹属重要的种，是“禹氏三角”的基础组成之一（A亚基因组）。

构建白菜泛基因组不仅能够获得白菜种丰富的基因信息，同时可以鉴定白菜基因组存在的广泛的遗传变异。

异源多倍化是物种形成和分化动力之一，异源多倍化会产生的亚基因组往往表现出亚基因组优势，而亚基因组优势反映了不同亚基因组的同源基因偏好性丢失和表达优势。白菜经历了多次基因组加倍，产生了3套亚基因，而亚基因组间同源基因非对称选择使种内产生分化，造就了白菜多样性的形态。

SV对植物的进化与性状变异有着重要影响，但目前针对白菜多样性形态与SV关系的研究尚未报道。

二、技术路线

三、材料方法

1、样本选择

16个不同生态类型的白菜用于泛基因组构建（BRO,CCA, CCB, CXA,CXB, MIZ, OIA, OIB, OIC, PCA, PCB, TCA, TUA, TUE, TBA和WTC）；

144个白菜品系用于重测序（结合之前数据，共524个样品）。

2、测序

基因组组装：三代Pacbio Sequel平台（平均25x），二代illumine（90x），Hi-C文库；

群体重测序BGI平台。

3、分析内容

基因组组装，SV检测（基于基因组），群体SV检测（基于重测序），图形泛基因组，祖先基因组构建，选择性清楚分析，等等。

四、主要结果

1、16个代表性白菜基因组组装?

16个品种分为6种形态，分别为大白菜、芜菁、油用白菜、苔菜、日本沙拉菜、小白菜；

16个品种单独de novo组装，基因组大小在337–466 Mb，contig N50 在0.25–1.41 Mb，其中12个品种使用hi-c测序挂载染色体，剩余4个利用reference-guided共线性分析挂载染色体；

16个基因组检测到44,207–47,602个基因，重复序列43.59–53.51%，重复序列和基因组大小成正相关（R =0.99, P = 3.8 e?16）；

以Chiifu为ref，其他17个与Chiifu之间共线性的比例存在差异（表1）；

以上结果说明，不同形态的白菜之间在基因含量、共线性、染色体结构上存在差异。

2、白菜泛基因组构建

白菜泛基因组包含47,107个基因，与单个基因组基因数相差不多，说明不同白菜品种基因组成比较接近；

基因家族分类（图b、c）

核心基因：18个基因组都包含；

次核心：80%以上基因组包含；

非必需：2-14个基因组包含；

特有：只在1个基因组包含；

基因表达显示，核心基因的表达水平高于非必需基因（图e）；

核心基因的CDS长度和数量高于其他类型基因（图f、g）；

LTR-RT更多出现在非必需基因中，说明TE促进白菜种内多样性的变异（图h）。

3、泛基因组分析揭示白菜种内的大量SV

使用全基因组7900个单拷贝直系同源基因构建了18个品种的进化树（图a），而后作者使用单条染色体分别构建进化树，结果显示与全基因组的并不完全相同，说明种内多样性的复杂进化历史；

基于524个样品的重测序数据构建的进化树，发现18个品种分布在不同形态的白菜分支中（图b）；

以Chiifu为ref，其他17个基因组比对鉴定SV，得到33.24–56.7Mb的insertions和35.75–58.84Mb的deletions；

对SV分析显示，SV富集在基因组重复区域（图e），随着基因组个数的增加，SV的数量逐渐增加至呈现饱和趋势（图f）；

利用hi-c数据鉴定到4个大片段的倒位（图g）。

4、共线性基因的灵活性与不同白菜基因组的分化有关

白菜基因组经历了多次染色体多倍化和基因丢失，使白菜基因组中包含3套亚基因组，因此作者试图分析白菜种内分化过程中由多倍化产生的基因的进化过程；

作者将在拟南芥和16-18个泛基因组样品中都存在同源基因，称为保守共线性基因（CSG），而在拟南芥和2-15个基因组存在同源基因，称为灵活共线性基因（FSG），FSG可能与白菜种内分化相关；

在18个不同的基因组中，FSG平均占基因总数的13.42%；

FSG中非同义/同义突变SNP的比例、含大效应突变位点的基因、积累的SV以及LTR-RT数量都显著高于CSG（图b、c）。

5、白菜种内分化过程中基因的灵活性扩大了LF亚基因组的优势

白菜基因组进化过程中多次基因组加倍事件和基因丢失，最终形成的基因组包含3个亚基因组LF、MF1、MF2，作者分析发现FSG的平均比例在LF中显著低于MF1和MF2（图e），而在18个基因组中FGS的频率要高于另外2个亚基因组（图d），说明白菜种内分化过程中偏好性基因灵活性的连续影响；

在18个基因组中FSG的比例在多拷贝基因集中显著高于单拷贝和两拷贝基因集，说明在种内分化过程中多拷贝基因更有灵活性；

种内分化过程中，多拷贝基因有着较高的灵活性（图g）。

6、推测的白菜祖先基因组为系统调查种内分化提供新的见解

作者将18个基因组的基因merge到一起，重构了白菜的祖先基因组，发现LF中的基因数和基因密度均高于MF1、MF2，说明LF亚基因组处于优势地位；

比较Chiifu和祖先基因组，发现单个基因组中LF、MF1、MF2中的基因密度显著低于祖先基因组（图a），说明在种内分化过程中大量基因丢失；

亚基因组比较显示，Chiifu中LF中丢失基因的密度低于MF1、MF2（图b），说明在种内分化过程中LF基因丢失较少；

作者重构了十字花科的祖先基因组和白菜、甘蓝祖先基因组，发现LF作为优势亚基因组保留了更多基因，而且LF亚基因组有较低比例的基因丢失。

7、SV变异与白菜种内分化

基于18个基因组比对获得的SV，构建白菜的图形泛基因组（以Chiifu为ref）；

524个样品重测序数据与图形基因组比对call sv，获得57877个高质量SV；

根据形态将白菜分为不同的组，通过组间比较，鉴定到1064个SV与结球性状相关，19个SV与小白菜驯化相关，172个SV与芜菁驯化相关，说明SV与不同形态的驯化相关；

作者鉴定到在BrPIN3.3中279bp的缺失影响叶球性状的驯化，作者通过以下6种方法验证基因的真实性：

基因内变异标记在结球和不结球群体中的分布差异性（图bcd）

基因侧翼SNP在结球和不结球群体中呈现不同的单体型（图a）

基因处在结球与不结球群体选择清除区域（图f）

拟南芥同源基因分析

基因在结球和不结球个体中的表达量分析

在更大的结球和不结球群体中扩增基因内的deletion，查看有无此变异

参考文献：

Xu Cai,Lichun Chang,Tingting Zhang,et al.Impacts of allopolyploidization and structural variation on intraspecific diversification in Brassica rapa.Genome Biology.(2021)22:166

（一）广泛引进国外花椰菜杂交品种自交分离创新种质资源

鉴于目前国内花椰菜种质资源贫乏的现状，直接从国外引进优良一代杂种，通过自交分离、纯化，从中筛选出优良的种质资源，是最经济、有效的获得新种质的方法。目前国内花椰菜育种单位利用该方法已分离了大批新的种质资源和自交系，并利用这些种质资源选育出许多优良的花椰菜新品种，如白峰、津雪88、云山1号、丰花60、厦花6号等目前生产上推广的绝大多数品种。

（二）种内杂交创造新类型

甘蓝类蔬菜的不同亚种或变种间很容易杂交，因此可以通过种内杂交方法，创造优异的种质资源甚至创造新的物种。孙德岭等（2002）采用花椰菜（白菜花）与青花菜、花椰菜与紫花菜、紫花菜与青花菜之间杂交。其后代花球的单球重大大提高，接近于花椰菜，色泽介于父本和母本之间，而维生素C的含量接近青花菜，比花椰菜提高22%～60.6%，全糖含量比青花菜增加9.8%～33.1%（表11-1），口味甜脆，品质和口感都优于其父本和母本，通过进一步选育有望选育出新的花椰菜类型，为花椰菜家族增加新的成员。

表11-1 花椰菜新类型全糖、维生素C含量

（三）生物技术与花椰菜种质资源创新

常规育种在花椰菜种质资源创新方面起了很大的作用，但通常存在能稳定遗传的有益基因狭窄或缺乏；多数有益基因是由许多微效基因控制，且该类基因选择较困难以及基因型差异难以确定等问题。随着生物技术的发展，在传统育种工作的基础上，可以提高育种的针对性，克服常规育种中一些难于解决的问题，进一步拓宽有益种质资源的创新和利用。目前已经有越来越多的研究者注重应用生物技术进行种质资源的创新。

1.细胞工程与花椰菜种质资源创新

（1）花药培养和游离小孢子培养技术 20世纪60年代初，Guha和Maheshwari开创了花药培养诱导单倍体的方法。此后花药培养成为诱导单倍体的重要途径之一，并且在作物育种中得到应用。在花椰菜上，王怀名（1992）对嫩茎花椰菜花药和花粉培养中的胚胎发生进行了研究，观察了花药中花粉粒发育成胚状体的过程和再生植株染色体倍性。张小玲（2002）等研究认为，磁场预处理可明显提高花药培养愈伤组织的诱导率。陈国菊（2004年）以5个花椰菜品种为材料进行花药培养，获得再生植株，并得到了种子。

由于花药培养的方法不能排除再生植株来自体细胞的可能性，多年来使花药培养获得再生植株的研究进展缓慢。而采用游离小孢子培养的方法可以很好地解决这一难题，因此，游离小孢子培养的方法获得再生植株越来越受到重视。目前该技术已陆续在芸薹属的大白菜、不结球白菜、结球甘蓝、芥蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、大头菜、叶芥、芜菁甘蓝和花椰菜等蔬菜上获得成功。北京农林科学院蔬菜研究工程中心、河南农业科学院园艺研究所、天津科润蔬菜研究所等单位先后开展了花椰菜游离小孢子培养工作，初步建立了花椰菜游离小孢子培养技术体系，在一些品种中获得了花椰菜DH株系，培育出花椰菜优良新品种。

通过游离小孢子培养可快速、有效地获得DH纯系。DH株系具有稳定的遗传特性，并能从亲本获得随机排列的配子，由于游离小孢子培养能快速纯合杂合亲本，因此对由多基因控制的特异性状的筛选能一步到位，明显提高了选择几率，加快育种进程。耿建峰等（2002）利用游离小孢子培养产生的两个自交不亲和系配制出具有早熟、耐热、花球洁白、品质好和抗病性强等综合性状优良的花椰菜DH杂交种“豫雪60”，孙德岭（2002）对引进的国内外育种资源材料461份，利用游离小孢子培养和常规技术相结合进行种质资源的创新和对DH株系材料进行评价及鉴定，选育出“津品50”。

游离小孢子培养技术也被应用于芸薹属远缘及种间杂交育种中。石淑稳等（1993）分别从甘蓝型油菜与诸葛菜的属间杂种，甘蓝型油菜与白菜型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜的种间杂种获得游离小孢子胚和再生植株，为芸薹属植物远缘及种间杂交育种建立了种质资源创新的途径。

（2）原生质体融合技术 原生质体融合也称体细胞融合，是两种原生质体的杂交，它不是雌雄配子间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，它可打破种间、属间存在的性隔离和杂交不亲和性，从而广泛地聚合各种优良的基因，使变异幅度显著增大，创造新的种质资源。因而此项技术越来越受到遗传育种学家的重视。自Carlson等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来，该技术体系不断完善和发展，在许多物种上细胞融合获得成功。20世纪80年代中期已报道有15个种内组合，38个种间组合，13个属间组合获得体细胞杂种植株，到90年代，通过体细胞杂交技术又添加了再生植株的种内杂种14个，种间杂种62个，属间杂种47个，并有2个科间组合的胞质杂种分化获得再生植株。在十字花科芸薹属中已获得融合杂种植株有：拟南芥油菜、甘蓝油菜、甘蓝+白菜型油菜、白菜型油菜+花椰菜。

原生质体融合技术与常规有性杂交的差别在于：体细胞杂交中没有减数分裂，有两个二倍体的细胞原生质体融合产生出四倍体的杂种植株，而用同样的亲本有性杂交则只产生二倍体杂种。

原生质体融合可以获得细胞质杂种，为培育细胞质雄性不育、抗除草剂等花椰菜品种提供了一条育种新途径。目前，通过有性杂交、回交转育的花椰菜细胞质雄性不育类型主要是Ogura胞质雄性不育类型和Polima胞质雄性不育类型。而利用常规育种转育年限一般需要6～11年，利用原生质体融合技术转移细胞质雄性不育基因可以克服有性回交转育所带来的年限长或杂交不亲和等问题，为花椰菜杂种优势的有效利用开辟了新的途径。惠志明（2005）进行了利用原生质体融合技术向花椰菜转移Ogura萝卜胞质雄性不育的研究，获得了花椰菜与Ogura萝卜胞质甘蓝型油菜种间体细胞杂种植株。由此可见，原生质体融合技术已经应用于花椰菜不育性的研究领域，已获得了大量的雄性不育转育植株，是一条培育雄性不育新种质行之有效的途径。

通过原生质体融合可以克服远缘杂交不亲和性，转移野生品种的抗逆性。花椰菜生产中常常遭受病虫害的威胁，而现有育种材料中存在的抗病、抗逆基因，由于长期的人工培育定向选择已日益狭窄，远不能满足进一步提高品种对病害及逆境多抗性的需要。增强对野生材料优异抗性基因的利用，是进一步创新育种基础材料的有效途径。蔬菜野生类型在长期自然选择下形成了高度的抗病性，通过与野生类型进行远缘杂交，可以大幅度提高现有品种的抗病性和抗逆性，但是远缘杂种通常表现不亲和性，严重限制了其在品种改良中的应用。利用原生质体融合技术得到的不对称杂种可以克服远缘杂交不亲和性转移野生种抗性。姚星伟（2005）利用原生质体非对称融合技术向花椰菜中转移野生种抗逆性状（供体Brassica spinescens具有光合效率高，抗白锈病、蚜虫、黑斑病和耐盐等优良特性），试验共获得17株杂种，其抗逆性在进一步鉴定中。可以看出，育种工作者越来越重视野生资源的发掘利用，生物技术中的细胞工程与分子生物学手段相结合是现阶段利用野生资源的有效途径。

利用原生质体融合技术可以转移某些品种优良品质性状，为改良花椰菜的营养品质提供新的途径。蔬菜的高产、优质一直是人们所追求的目标。P.S.Jourdan（1989）利用花椰菜与具有除草剂抗性的Brassica napus进行原生质体融合试验，获得了具有高抗除草剂特性的杂种植株。B.Navratilove等（1997）以花椰菜和抗根瘤病的Armoracia rusticana为试验材料，利用原生质体融合技术，获得了花椰菜与Armoracia rusticana体细胞杂种植株。Hu（2002）用Brassica napus和具有亚油酸和软脂酸含量高的Orychophragmus violaceus进行体细胞融合试验，通过原生质体融合试验得到的杂种植株不但亚油酸和软脂酸含量升高，而且芥子酸的含量明显下降，显著改善品种品质。

2.分子标记技术与花椰菜种质资源创新

利用易于鉴定的遗传标记辅助选择是提高选择效率和降低育种盲目性的重要手段。近20年迅速发展起来的分子标记技术给作物育种提供了新的途径。运用DNA分子标记可以进行早期选择，提高选择的准确度和育种效率，有助于缩短育种周期。

（1）利用分子标记技术筛选自交不亲和系 自交不亲和性是高等植物为实现异花授粉受精和遗传重组而形成的一种重要的遗传特性，国内外学者对自交不亲和性的遗传机制做了大量研究。据Lewis（1979）报道，已在74个科的被子植物中发现了自交不亲和性。国内利用分子标记技术筛选自交不亲和系的研究也有所报道，黄聪丽（2001）应用RAPD分析方法，得到了与花椰菜自交不亲和性相关的差异片段。宋丽娜（2005年）运用RAPD和ISSR分子标记技术，分离到鉴别自交不亲和性的连锁标记。

（2）利用分子标记技术鉴定抗病种质资源 张峰（1999）利用AFLP技术在一对花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中筛选到4个与抗黑腐病基因紧密连锁的标记。刘松（2002）用天津科润蔬菜研究所抗黑腐病近等位基因系C712和C731作为材料，筛选出与花椰菜抗黑腐病基因RXC连锁的RAPD标记OP224/1600，将其转化成更加稳定的SCAR标记，可快速准确筛选抗病材料。古瑜（2007年）以花椰菜抗病和感病近等基因系为实验材料，对花椰菜抗病和感病近等基因系基因组进行了ISSR分析，得到3个与抗病基因有关的分子标记ISSR11000、ISSR21500和ISSR18700，可进一步应用于分子标记辅助育种。此外，利用cDNA-AFLP技术对致病菌胁迫的花椰菜抗黑腐病系进行差异表达分析，初步得到一个与抗黑腐病相关的基因片段，并证实该片段是受诱导的与诱导系统抗性（ISR）信号传导有关的基因片段。此外，利用同源序列候选基因法和NBS profiling方法，在抗病系中得到2个抗病基因同源序列RGA330-7和NBS5-100，序列分析表明这两个片段可能与花椰菜抗黑腐病基因有关。进一步将两个RGA推测的蛋白序列与7个已知植物抗病基因的蛋白序列进行比较，构建了分子进化树。聚类结果表明，本研究得到的两个RGA片段应属于non-TIR-NBS-LRR型。最后，利用表观遗传学的分析方法，对致病菌胁迫前后基因组中胞嘧啶甲基化水平和甲基化模式的变异进行分析，从基因表达调控的角度探讨了抗黑腐病的分子机制。

（3）利用分子标记技术检测遗传变异 突变既可以发生在整个基因组，也可以发生于特定的基因或基因簇、结构基因、调节基因，以及单个核苷酸等。突变既可以自发也可以人工诱变在不用诱变剂处理的培养植物细胞中，突变体频率一般为10-5～10-8，用诱变剂处理，可增至10-3，但诱变剂常会引起育性降低等副作用。Leroy（2000，2001）等利用花椰菜下胚轴进行组织培养，用ISSR方法检测了愈伤组织形成过程、胞增殖过程以及成苗后的再生植株等各阶段的植株间多态性，认为组织培养诱导的再生植株具有遗传多态性，证明组织培养可诱发与筛选遗传变异。

（4）利用分子标记技术筛选花椰菜雄性不育种质资源 植物雄性不育是一种不能产生有活力花粉的遗传现象，在植物界中广泛存在，目前已在43科162个属320个种的617个品种或种间杂种中发现了雄性不育现象，它在作物杂种优势利用上具有重要价值。

Chunguo Wang（2006）以花椰菜雄性不育品种NKC-A和恢复系NKC-B为材料，利用引物P6+/P6-进行PCR扩增，发现了一条300bp的差异片段，此片段可以作为鉴别雄性不育系的分子标记。王春国（2005）利用同源序列的候选基因法，通过检索NCBI核酸以及蛋白数据库，获得花椰菜kndx612细胞质雄性不育相关的基因或开放读码框，初步结果显示试验所用不育花椰菜胞质亦可能为Ogura型，为进一步从分子水平研究和利用花椰菜雄性不育基因提供了条件。

（5）花椰菜遗传连锁图谱的构建及在育种中的应用 遗传连锁图谱是指以染色体重组交换率为相对长度单位，以遗传标记为主体构成的染色体线状连锁图谱，分子标记遗传连锁图表示各标记所对应的DNA片段在染色体上的相对位置，是分子标记运用于作物遗传育种的基础，构建分子标记连锁图的理论基础是染色体的交换和重组。自1986年以来，主要农作物都已建立了以RFLP为主的分子遗传图谱，分子标记连锁图，是进行基因定位、基因克隆、辅助选择进行作物设计育种的技术平台。在遗传学理论、功能基因组学以及遗传育种等领域已显示出了十分重要的作用。

Li（2001年）等利用SRAP、AFLP技术对86个羽衣甘蓝×花椰菜的RI作图，此图由130个SRAP标记和120个AFLP技术构成，这些标记非常平均地分布在9个连锁群，覆盖2165cM。古瑜（2007年）利用AFLP和NBS profiling两种方法，以花椰菜品种间杂交F2代为作图群体，构建了第一张花椰菜遗传连锁图谱。该图谱包括9个连锁群，连锁群的总长度为668.4cM，相邻标记间的平均图距为2.9cM，在所包含的234个AFLP标记和21个NBS标记中NBS标记分布于8个连锁群且在基因组中成簇排列。该图谱通过提供可能的抗性基因位点，对进一步得到抗性基因很有帮助。同时研究RGA在整个花椰菜基因组中的分布与组成，也为了解抗性基因的分布与演化提供参考。进一步可用于分子标记辅助育种。

（6）花椰菜不同花色种质资源的创新 近年来，利用基因工程技术已经获得了许多传统园艺技术难以获得的新品种，如紫色、白色以及紫白相嵌的3种不同颜色的矮牵牛花。而这些技术通常要求对相关基因有所了解，以获得目的基因的cDNA，然后将这些外源基因导入目标植物中，达到改变花色、花型等目的。Crisp等利用遗传上一致的白色花球品种和绿色品种杂交，从杂交后代遗传表现提出一种模型：Wiwi基因控制白色对**是显性，非独立共显性基因gr1gr2表现为绿色。Dickson报道了在埃及引进的花椰菜品种PI 183214，即便完全暴露于阳光下，花球也是纯白色的。并认为是由2或3对显性基因控制的。Singh等报道了由两对基因控制的可以遮盖住花球的叶片，以防止阳光照射引起的花球变色。李凌等（2000）对花椰菜黄花和白花的近等基因系进行了研究，筛选到了一个白花株系的特异带，通过Northern点杂交初步鉴定其为白花株系所特有，同时利用Smart cDNA-AFLP银染技术对花椰菜黄花近等基因系的mRNA进行了分析，其中2对引物的3条带在2个表达基因文库之间存在多态性，其中一条与白花品系共分离；筛选到一条白花株系的差异片段，本研究为克隆与花色相关基因奠定了基础。

3.转基因技术与花椰菜种质资源创新

转基因技术的发展对加速创新花椰菜种质资源具有重要意义。目前，已育成一大批雄性不育、抗病、抗虫、品质优良的花椰菜新品种，并产生了很大的社会和经济效益。

（1）花椰菜雄性不育种质资源创新 近年，花椰菜雄性不育研究取得了进展，已从中找出一些与不育相关的基因或者嵌合体。这对进一步阐明花椰菜雄性不育发生的分子机理，指导新不育系的培育打下了基础。Bhalla（1998）把与花粉相关的基因Bcp1整合到质粒PBI101中，通过根瘤农杆菌介导转入花椰菜子叶中，获得了50%花粉不育的花椰菜不育新种质。

（2）花椰菜抗病虫种质资源创新 在花椰菜抗病基因的克隆和转移方面也有报道，张桂华等（2001）以花椰菜栽培品种“春秋”为试验材料，在携带CaMV Bari-1基因Ⅵ的根瘤农杆菌菌种GV3101的介导下，获得了经筛选转化的花椰菜转基因幼苗，为培育抗花椰菜花叶病毒型品种提供可能。

花椰菜转基因抗虫研究中最常用的外源基因有两种：内毒素（Bt）基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因，这两种基因已经成功转入花椰菜中，为利用转基因技术创新花椰菜种质资源提供了宝贵经验。

华学军（1992）、蔡荣旗（2000）、徐淑平（2002）、周焕斌（2003）等都利用农杆菌介导将Bt基因转入花椰菜中，成功获得了转基因植株。

CpTI基因属于Bowman-birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制包括鳞翅目、鞘翅目、直翅目等多种害虫中肠中胰蛋白酶的活性，具有广谱抗虫性。吕玲玲（2004）通过根瘤农杆菌介导，将豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因整合到花椰菜植株的基因组中，对鳞翅目虫害青虫的生长发育有一定的抑制作用。徐淑平（2002）用根癌农杆菌介导的遗传转化法将Bt基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI）导入花椰菜，获得了转基因花椰菜植株。Ding（1998）等利用农杆菌介导，从当地甘薯中分离得到的抗虫基因TI转入花椰菜中，结果表明，转基因植株比对照植株抗虫效果明显。

（3）与花椰菜花球性状有关的突变基因的研究进展 Bowman（1993）等首先在拟南芥中发现了花球突变体cauliflower。随后Kempin SA（1995）等从拟南芥中分离得到两个与花的分生组织活性有关的CAULIFLOWER和APETALA1基因，研究表明：其功能为转录因子。同时对花椰菜栽培种中该基因的同源基因研究发现：花椰菜中其同源基因是无功能的。这暗示了花椰菜肉质花序形态的形成机理与该基因密切相关。Purugganan（2000）等研究了野生型和栽培型花椰菜中CAL基因的多态性，发现野生型和栽培型CAL基因存在差异，栽培型花椰菜中该基因的第五个外显子有一个等位基因位点发生了突变。Lee B.Smith（2000）以BoCAL和BoAP1两个隐性等位基因在特殊位点上的分离为切入点，研究了花椰菜花球的起源和进化过程，得到花球发育的遗传模式，认为：BoCAL-a等位基因与离散花序的形态之间存在很强的相关性。以上的结果都表明：CAL基因的突变抑制花分生组织发育，这是花椰菜花球形成的遗传基础。赵升等（2003）、曹文广（2003）、李小方（2000）通过把甘蓝BoCAL基因转入花椰菜中，转基因花椰菜不能形成花球，证实外源基因BoCAL能够部分补偿花椰菜BobCAL基因功能的丧失，部分恢复花椰菜的花球表型。因此可以通过控制BoCAL基因的突变程度和基因的表达水平，调节花球的发生时间和发育速度，从而为培育结球紧实度高的花椰菜新品种提供新的途径。

在生产实际中，花球采收后，其内源激素和营养成分的变化造成内在品质逐渐降低，严重的影响产品的商品性和食用的营养价值。花球的衰老首先出现在萼片的叶绿素丧失。乙烯的合成与叶绿素的丧失以及随后的黄化成因果关系。ACC氧化酶（ACO）是乙烯合成的一个限速酶，并且ACO基因的表达调控着乙烯的生成速率。从基因上对ACO基因的表达进行调控，可延缓乙烯的生成，这已经在许多作物上获得成功。陈银华（2005年）根据亲缘关系较近的几种作物ACC氧化酶氨基酸序列，设计一对简并引物，从花椰菜基因组中获得长1202bp的候选片段，并获得花椰菜抗衰老的新材料。