可以在水稻原生质体里转化的载体需要满足什么条件

水稻原生质体分离与转化方法

（储成才 课题组 2014-01-20）

概述原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。

一、实验的前期准备：

1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。

2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。

二、试剂和耗材：

1. 耗材：耗材准备如下表所示。

50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液

250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体

A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片

玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台

50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体

2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化

双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘

0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液

细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体

2. 试剂准备：

(1) Enzyme solution

0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g

10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g

1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g

0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 g

D-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。用1M KOH 调pH 至5.7，然后65℃水浴10min ，过0.22μM 滤膜除菌至无菌三角瓶中（注意pH 值一定要准确，否则将极大的影响原生质体的制备效率。Cellulase R-10可以用Cellulase RS 代替，但是Cellulase RS 的最适pH 大约为6.0左右）。待酶液冷却至室温后，加入如下试剂： 0.1% BSA

0.025 g 0.05 g 0.1 g 3.4 mM CaCl 2 (M=110.99) 0.0095 g 0.019 g 0.038 g 50 mM β-ME (14.3 M) 8.75 μL 17.5 μL 35 μL

50 μg/ml Carbenicillin

1.25 mg

2.5 mg

5 mg

(CaCl 2可配制1M CaCl 2，然后加入85 μL/ 25 mL ，Carbenicillin 配制50 mg/ mL 的母液)。 (2) W5 Solution 154 mM NaCl (M=58.44) 0.9 g 1.8 g 3.6 g 125 mM CaCl 2 (M=110.99) 1.39 g 2.78 5.56g 5 mM KCl (M=74.55)

0.037 g 0.074 g 0.148 g 2 mM MES (M=195.24, pH=5.7)

0.039 g

0.078 g

0.156 g

用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (3) MMg Solution 0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 10.93 g 15 mM MgCl 2 (M=95.22) 0.143 g 4 mM MES (M=195.24, pH=5.7)

0.078 g

用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (4) 40% PEG Solution 0.6 M D-Mannitol 0.546 g

10.93 g 100 mM CaCl 2

0.5 mL (1M CaCl 2) 1.11

g 40% (v/v) PEG 4000 (Fluka, Sigma-Aldrich )

2 g (体积约等于1.75 mL)

40 g

Tips ：由于PEG 吸水后体积会膨胀，所以必须在定容前给PEG 留出一部分体积。配制该

溶液时先溶解D-Mannitol 和CaCl 2后，再加入PEG ，65℃水浴加热10min 至完全溶解后，再定容到最终体积。

三、实验步骤

1. 原生质体制备：

(1) 预先配制0.6 M D-Mannitol 溶液100 mL 。

(2) 将培养的水稻苗从茎基部截断后，用刀片切成0.5 mm 薄片，每次4-5颗苗/1个刀片(茎部比较好，叶片的细胞比较小，去除衰老的叶鞘)。将切好的水稻细条迅速转移入0.6 M D-Mannitol 溶液中，在常温下60-80 rpm 培养30 min 。

(3) 用神奇滤布（Miracloth）过滤后，再药匙将滤布上的水稻薄片转移入含有酶液的250 mL 三角瓶中（三角瓶需用锡箔纸包住，避免见光）。放入28℃摇床，在黑暗条件下60-80 rpm酶解4-5 h。

Tips：以上步骤为节省时间，也可以直接将切好的水稻薄片转移入酶液中进行酶解。如果不经过0.6 M Mannitol质壁分离预处理的，则需抽真空半小时（15 mmHg）。

(4) 取10 μL在光学显微镜下观察原生体的完整性，健康的原生质体为边缘清晰的圆形游离态。

(5) 加入与酶液等体积的W5 Solution，用力摇晃15 s，充分释放原生质体。

(6) 用W5 Solution润洗灭菌过的网筛(35 μm, 100目), 将酶解的原生质体通过网筛，过滤到新的250 mL三角瓶中。再用少量W5 Solution冲洗网筛，充分洗脱网筛上的原生质体，并将其全部转入250 mL三角瓶中。

(7) 将三角瓶中的原生质体分装到两个50 mL透明离心管中，水平转子450 g（大约1500 rpm）离心3 min（注意调整升降速为3），小心去除上清。

(8) 加入15 mL W5 Solution重悬原生质体，并于450 g 离心3 min。小心去除上清后，重悬原生质体于1 mL MMg Solution中，使细胞的终浓度为1-5×106 cell/mL。

2. 原生质体转化：

(1) 在2 mL离心管中加入5-10 μg 质粒，再加入100 μL制备好的原生质体，并轻柔地吸打混匀。

(2) 加入110 μL 40% PEG，并迅速轻柔混匀，勿使原生质体成团。

(3) 置于28 ℃水浴15 min，加入1.8 mL W5 Solution重悬，并终止反应。

(4) 将2 mL离心管套在10 mL离心管中，水平转子450 g离心3 min。

(5) 用移液器小心吸除上清后，重悬原生质体于750 μL W5 Solution中。

(6) 转移原生质体到12孔细胞培养板里，用封口膜包好后，于28℃避光培养12-16h。Tips：原生质体的转化体系一定要按比例放大，否则PEG浓度的改变会导致转化效率的降低。用于Co-localization和BiFC等共转化实验需要的质粒要更多更纯。

四、亚细胞定位以及BiFC的载体信息

1. 用于亚细胞定位的载体有：

pCAMBIA2300-35S-EGFP(N)：EGFP融合于目的蛋白N端。可用来做瞬时表达和稳定表达。pCAMBIA2300-35S-EGFP(C)：EGFP 融合于目的蛋白C端。可用来做瞬时表达和稳定表达。(这两个载体可用于稳定转化水稻、拟南芥和烟草，注意农杆菌分别对应AGL1和GV3101。) pUC-35S-EGFP(Modified): eGFP融合于目的蛋白N端。仅可用来瞬时表达。

pSAT6-EYFP-C1(35S,CD3-1103)：eGYP融合于目的蛋白N端。仅可用来瞬时表达。

pSAT6-EYFP-N1(35S,CD3-1104)：eGYP融合于目的蛋白C端。仅可用来瞬时表达。

2. 用于BiFC的载体有（双分子荧光互补的载体是成对的）：

pSPYNE173和pSPYCE（M）：分离的EYFP融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达。pSCYNE和pSCYCE：分离的CFP融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达。

pVYNE和pVYCE：分离的Venus融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达和稳定表达。pVYNE(R)和pVYCE(R)：分离的Venus融合于目的蛋白的N端，用于瞬时表达和稳定表达。Tips：在转化原生质体时，应当尽量采用 ~4.5 kb的质粒。越小的质粒转化效率越高，蛋白荧光越强。

五、共定位蛋白参照

我们实验室现有的共定位蛋白参照如下：

Endoplasmic reticulum ER-RFP（RFP-HDEL） Unknown Golgi Golgi-RFP（SialT-RFP） Unknown

Tonoplast Alpha-TIP-RFP

Gamma-TIP-RFP

Delta-TIP-RFP At1g73190 At2g36830 At3g16240

Chloroplast RbcS-EGFP Os12g0291100 Nuclear OsbZIP52-mRFP Os06g0662200

此外，还有一些共定位蛋白参照可以参考：

Chloroplast OsRbcS Os12g0292400 Chloroplast OsRbcA Os11g0707000 Mitochondrion OsRpl6-2 Os08g0484301 Mitochondrion OsAtpC Os07g0513000 Nuclear OsSRT1 Os04g0271000 Golgi Golgi-mCherry（Man49-mCherry）Unknown

Golgi OsNST1 Os02g0614100 Endoplasmic reticulum DEP2 Os07g0616000

六、荧光蛋白的基本特性

目前，常用的一些荧光蛋白的基本性质总结如下：

Aequorea FP derivatives (水

母来源的荧光蛋白)

Cyan (CFP) 433/452 475/505 Monomer/weak

dimer

Cerulean 433 475 Monomer/weak

dimer Enhanced green (eGFP) 488 506 Monomer/weak

dimer Enhanced yellow (eYFP) 514 527 Monomer/weak dimer

Venus 515 528 Monomer/weak

dimer Citrine 516 529 Monomer/weak

dimer Anthozoa FP derivatives (珊

瑚来源的荧光蛋白)

mOrange 548 562 Monomer

Red (RFP) 555 584 M

水稻倒伏后要及时补救，其主要措施有：

①及时开沟排水轻搁田。这对减缓纹枯病蔓延，延长叶片功能期，促进籽粒继续灌浆，防止穗发芽和茎秆腐烂，都有积极作用。

②根外喷施磷酸二氢钾。每亩用磷酸二氢钾200克，兑水10公斤叶面喷施。

③用5%井岗霉素100克，兑水10公斤喷施防治纹枯病。井岗霉素和磷酸二氢钾可以药肥混施。

④倒伏后不宜扶稻扎把。切记水稻倒伏后不要扶稻扎把，因为倒伏的稻株一般都是顺势向后倒伏的，稻穗、穗茎节和倒一叶、倒二叶基本都暴露在表面，倒伏后3～5天，由于稻株的自动调节作用，会使叶片和穗轴自动翘起，特别是倒伏不太严重的田块，稻株自动调节能力更强。而倒伏后扶稻扎把，反而会人为地破坏稻穗、穗茎、叶片的自然分布，使机械损伤加重，造成倒伏损失更为严重。