求论文《水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究》

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水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究

摘要

我国水稻秸秆资源丰富，年产量达3亿多吨。利用水稻秸秆生产燃料乙醇，对

来我国能源问题、实现节粮代粮和环保有着巨大的潜力和广阔的应用前景。水稻秸

要成分是纤维素，对纤维素的利用最主要的限制性因素是将纤维素转化为可发酵还

解决的办法主要有两类途径:(l)提高纤维素酶生产的经济性，主要涉及纤维素酶高

获得及纤维素酶的生产技术，提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产成本;(2)提

素酶利用效率，主要涉及纤维素酶解催化过程，以降低单位可发酵还原糖生产成本

本研究从菌种的选育着手，研究了菌株的产酶特性，用响应面策略优化发酵培养基，

了SL发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶技术;分离纯化了纤维素酶;构建了代

二糖的酿酒酵母工程菌;对酿酒酵母工程菌细胞固定化发酵进行了研究，利用二级

生物反应器祸合系统生物协同酶解水稻秸秆发酵生产燃料乙醇等。主要研究结果如

1.筛选到一株纤维素酶高产菌株(PenicilliumYT01)，原生质体紫外诱变后

变株YT02，YT02以水稻秸秆为碳源，豆饼粉和硫酸钱为氮源，在29”c，初始p

酵12Oh，纤维素酶活力达到最高，摇瓶发酵滤纸酶活(FPA)、CMC酶活(CMcas

葡萄糖昔酶活(CB)分别达3.86IU/mL、207.41IU/mL和l.4oIU/mL。

2.用响应面方法(RSM)优化的发酵培养基组成为:水稻秸秆为41.95留L，

为24.83g/L，数皮为22.16叭，困H4)2504、KHZpO4为4g/L，MgSO;为0.sg/L;起始

以优化的培养基发酵120h，滤纸酶活、cMc酶活和p一葡萄糖普酶活分别达到

IU/mL、357.41IU/mLand3.704IU/mL。远高于优化前的纤维素酶活水平。

3.在SL发酵罐中研究了温度、pH值和溶氧对菌体生长和产酶的影响，确定

发酵的工艺条件为:0一32h时发酵温度犯”C，溶氧70%;犯h至1加h发酵结果发

29oc，溶氧50%，发酵液初始pH值6.0，发酵%h滤纸酶活、CMC酶活和p一葡

酶活分别达到11.13IU/mL、465.24IU/mLand4.08IU/mL，均高于摇瓶发酵水平，

酵动力学过程显示，突变菌YT02菌体生长和纤维素酶各组分均为部分祸联。

4.利用DEAEsephadexA一25和sephadexG一75分离纯化了二个内切葡

(CMCase)和一个p一葡萄糖营酶，CMCase纯化倍数为13.48，回收率为10.54%，

糖昔酶纯化倍数为18.62，回收率为8.62%，经SDS一PAGE得到单蛋白分子条带，

I

、沪’_心钳3卜“’门尸，..

量测定分别为73kDa、43kDa和57.8kDa，并对其进行了N端测序和质谱分析。

5.以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN一27作为工程菌株的受体菌。利用

能良好的多拷贝整合型载体pYMIKP，使纤维二糖代谢基因BGLI整合到酿酒酵母

体上。从而在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径，拓展了酒精生

物利用范围，降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固

纤维二糖酿酒酵母工程菌，固定化细胞与游离细胞相比，发酵时间缩短，乙醇产率提

以上，并能有效地利用水稻秸秆水解液进行酒精发酵。

6.对水稻秸秆酶解过程中底物性质、酶解温度、酶解pH、底物浓度及纤维素

等关键因子进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维二搪酶活力较低(CB/F队为

经稀酸稀碱预处理后的水稻秸秆纤维素对乙醇转化率仅为18%。采用代谢纤维二糖

母工程菌游离细胞发酵，可部分去除纤维二糖对酶解的抑制，水稻秸秆纤维素对乙

率可提高至20%。进一步利用采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工

酵，水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可达26%。这方面的研究结果有助于深入了解纤

的协同降解机制。

7.将纤维原料的酶解、固定化代谢纤维二搪酿酒酵母工程菌的作用有机祸联，

新型的二级串联式生物反应器，在该反应器体系的协同作用下，可有效解除纤维二

萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用，促进纤维原料水稻秸秆的酶水解，发酵40h，乙

达25.5留L，纤维素对乙醇的转化率达43.0%(纤维素对乙醇的理论转化率为56.61

是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的1.65倍，生产效率达0.64留(Lh)。采用分批添料

酶解发酵工艺，可提高纤维底物的终浓度达250岁L，产物乙醇的终浓度66.51留L，

高了纤维素酶的利用率和乙醇生产效率，降低乙醇的生产成本。该反应器性能稳定

效率高，固定化细胞可以重复使用，便于自动化控制。

关键词:纤维素酶，水稻秸秆，酿酒酵母，燃料乙醇，串联式生物反应器

目录

摘要..............................................................……

ABSTRACT..........................................................……IH

第一章文献综述

l水稻秸秆资源及其降解方式............................................……l

1.1水稻秸秆的组成与结构..…，................................……，.……l

1.2水稻秸秆的预处理..................................................……3

1.2.1物理方法预处理水稻秸秆..........................................……3

1.2.2化学方法预处理水稻秸秆..........................................……3

1.2.3生物方法预处理水稻秸秆..........................................……4

1.3水稻秸秆纤维素的降解方式..........................................……4

1.3.1水稻秸秆的酸水解................................................……5

1.3.2水稻秸秆的酶水解................................................……5

2纤维素酶的性质与用途................................................……6

2.1纤维素酶的多酶体系................................................……6

2.2纤维素酶的分子结构................................................……7

2.3纤维素酶的作用机理................................................……9

2.4纤维素酶的分子量大小.............................................……10

2.5纤维素酶的最适反应条件与稳定性...................................……11

2.6纤维素酶的应用...................................................……H

3纤维素酶的生产.....................................................……12

3.1纤维素酶的生产菌种选育...........................................……12

3.2纤维素酶的生产...................................................……14

4水稻秸秆原料生物转化燃料乙醇.......................................……15

4.1燃料乙醇的优越性和使用现状.......................................……15

4.2水稻秸秆纤维素生物转化燃料乙醇的方法.............................……16

4.2.1分步水解发酵法生产燃料乙醇.....................................……16

4.2.2同步糖化发酵法生产燃料乙醇.....................................……16

i

4.2.3固定化细胞发酵生产燃料乙醇.....................................……17

4.3酉良酒酵母途径工程应用于燃料乙醇的生产.............................……17

5本研究的目的、意义和主要内容.......................................……19

5.1本研究的目的和意义...............................................……19

5.2本研究的思路和技术路线...........................................……20

5.3本研究的主要内容.................................................……21

第二章纤维素酶高产菌株的选育及产酶条件研究.........................……23

1材料与方法..........................................................……23

1.1材料.............................................................……23

1.1.1试剂与溶液配制.................................................……器

1.1.2菌种与菌种分离源...............................................……24

1.1.3培养基.........................................................……24

1.1.4主要仪器与设备.................................................……25

1.2方法.............................................................……25

1.2.1水稻秸秆的预处理...........................……，.，...........……25

1.2.2纤维素酶高产菌的分离与纯化.....................................……25

1.2.3纤维素酶高产菌的初步鉴定.......................................……25

1.2.4纤维素酶高产菌的原生质体紫外诱变...............................……25

1.2.5YTOZ产纤维素酶的液体发酵培养方法...............................……26

1.2.6不同预处理水稻秸秆的酶水解.....................................……27

1.2.7分析方法.......................................................……27

2结果与分析.........................................................……29

2.1不同预处理水稻秸秆的各组分含量...................................……29

2.2纤维素酶高产菌的分离与筛选.......................................……29

2.3纤维素高产菌YT01的菌种鉴定......................................……31

2.4纤维素酶高产菌YT01的原生质体紫外诱变............................……31

2.5液体发酵培养基成分与发酵条件对YT02产纤维素酶的影响..............……32

2.5.1不同碳源对YT02产酶的影响......................................……32

2.5.2不同预处理水稻秸秆对YT02产酶的影响............................……33

2.5.3不同氮源对YT02产纤维素酶的影响................................……34

ii

2.5.4微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响........................……35

2.5.5不同无机盐对YT01产纤维素酶的影响..............................……35

2.5.6起始pH对YT01产纤维素酶的影响.................................……36

2.5.7装液量对YT02产纤维素酶的影响..................................……37

2.5.8转速对YT02产纤维素酶的影响....................................……37

2.5.9培养温度对YT02产纤维素酶的影响................................……38

2.5.10接种量对YT02产纤维素酶的影响.................................……39

2.5.n培养时间对YT02产酶的影响.....................................……40

2.6纤维素酶的酶学性质研究...........................................……41

2.6.1温度对纤维素酶各组分酶活的影响................................……41

2.6.ZPH对纤维素酶各组分酶活的影响..................................……41

2.7纤维素酶对不同预处理水稻秸秆的酶解试验...........................……42

3结论与讨论...............................................··········……4:l

3.1关于筛选出的纤维素酶高产菌株....................................……4:3

3.2纤维素酶生产菌的改造............................................……招

3.3青霉YT02产酶条件与酶学特性.....................................……44

第三章YT02产纤维素酶发酵培养基的优化研究..........................……45

1材料与方法....................................···.·················……45

1.1材料.............................................................……45

1.1.1试剂................................................·.·.·······……45

1.1.2供试菌种.......................................················……45

1.1.3培养基................................................·········……45

1.1.4主要仪器与设备.................................................……46

1.2方法.............................................................……4尽

1.2.1实验设计.............................................··········……46

1.2.2培养方法.............................................··········……46

1.2.3分析方法.......................................................……46

2结果与分析..............................................···········……47

2.1部分因子实验筛选发酵培养基的主要影响因子.........................……47

2.2最陡爬坡实验逼近发酵培养基最优点.................................……50

111

2.3中心组合设计优化YT02发酵培养基组成..............................……51

2.4发酵过程中PH、残余还原糖与纤维素酶变化的测定结果.................……59

3结论与讨论...................................……，...............……61

第四章YT02分批发酵产纤维素酶的研究................................……63

材料与方法.........................................................……63

.1材料.............................................................……63

.1.1试剂...........................................................……63

.1.2菌株...........................................................……63

.1.3培养基.........................................................……娜

.1.4主要仪器.......................................................……64

方法.....................·······……

.1用于分批发酵的种子培养.........……

.…64

.…64

1.2.2恒温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响.............................……64

1.2.3变温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响.............................……64

1.2.4溶氧量对YT02分批发酵产纤维素酶的影响...........................……64

1.2.5分段溶氧对YT02分批发酵产纤维素酶的影响.........................……65

1.2.6分析方法.......................................................……65

2结果与分析.........................................................……65

2.1发酵温度对YT02产纤维素酶的影响结果..............................……65

2.2变温发酵对YT02产纤维素酶的影响结果..............................……68

2.3溶氧对YT02产纤维素酶的影响结果..................................……69

2.4分段溶氧分批发酵对YT02产纤维素酶的影响结果......................……72

3结论与讨论.........................................................……73

第五章YT02产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究...........……

以U（b叮‘叮‘

（bt了叮‘叮‘

材料与方法…

.1材料.……

.1.1试验材料.

.1.2主要试剂.

....……76

.....……76

.3常用储备液及缓冲液....................................……

1.1.4主要仪器........................................................……78

1.2方法..............................................................……78

1.2.1蛋白质浓度的测定方法...........................................……78

1.2.2纤维素酶的分离纯化.............................................……79

1.2.3纤维素酶SDS一PAGE凝胶电泳纯化及酶相对分子量的测定..............……83

1.2.4酶蛋白的N端测序...............................................……85

1.2.5酶蛋白的质谱分析...............................................……86

2结果与分析.........................................................……87

2.1DEAE一SephadexA一25阴离子交换层析结果.............................……87

2.1.1层析收集管酶蛋白同洗脱缓冲液NaCI浓度的关系.....................……87

2.1.2层析收集管酶蛋白活性检测.......................................……88

2.25即hadexG一75分子筛凝胶过滤层析结果..............................……88

2.2.1SephadexG一75分子筛凝胶过滤层析分离酶蛋白......................……88

2.2.2分子筛凝胶过滤层析纤维素酶活测定结果...........................……88

2.3纤维素酶各纯化步骤纯化情况.......................................……89

2.4SDS一PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳.......................................……90

2.4.1SDS一PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳银染结果.............................……90

2.4.2纤维素酶分子量SDS一PAGE凝胶电泳测定结果........................……91

2.5酶蛋白的N端测序结果.............................................……91

2.6酶蛋白的质谱分析结果.............................................……93

3结论与讨论.........................................................……94

第六章酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建及其细胞固定化研究.............……96

材料和方法................................................·········……%

1材料.............................................................……96

1.1菌株和质粒.....................................................……96

1.2分子克隆用酶和试剂.............................................……96

1.3水稻秸秆水解液的制备...........................................……97

2方法.............................................................……98

2.1含纤维二糖酶基因(及咒1)的重组质粒pYMIKP一那艺了的构建方法.......……98

2.2酿酒酵母纤维二糖代谢途径的搭建方法.............................……99

1.2.3酿酒酵母工程菌细胞的固定化方法................................……101

1.2.4固定化酵母细胞发酵方法........................................……102

1.2.5分析方法......................................................……102

2结果与分析........................................................……103

2.1表达及范了基因的重组菌株的构建结果...............................……103

2.1.1目的基因及法了的获得...........................................……103

2.1.2含目的基因那Z了重组质粒的构建.................................……103

2.1.3酿酒酵母工业菌株NAN一27转化子的获得二，........................……104

2.1.4转化子NAN一28细胞纤维二糖酶活性测定结果.......................……1()4

2.2不同固定化条件对NAN一28细胞固定化的影响结果.....................……105

2.2.1不同溶剂对固定化细胞转化纤维二搪的测定结果......……，.......……105

2.2.2不同海藻酸钠浓度对固定化细胞凝胶特性的影响....................……l()5

2.2.3酵母包埋量对固定化细胞转化纤维二糖的影响结果..................……!06

2.3固定化细胞与游离细胞分批发酵实验结果............................……l()6

2.4固定化细胞重复分批发酵试验结果..................................……107

3结论与讨论........................................................……108

3.1酉良酒酵母纤维二糖代谢途径的构建.................................……108

3.2酿酒酵母工程菌细胞固定化.......................................……110

第七章串联式生物反应器转化水稻秸秆生产燃料乙醇的研究..............……112

材料与方法........................................................……112

l材料......................................……，..............……112

1.1试剂.........................................................……112

1.2菌种.........................................................……112

1.3主要仪器与设备...............................................……112

2方法...........................................................……112

2.1稻草粉的预处理................................................……112

2.2纤维素酶的制备................................................……113

2.3稻草粉的酶解糖化..............................................……113

2.4水稻秸秆生物转化燃料乙醇......................................……114

2.5测定方法......................................................……115

vi

2结果与分析........................................................……116

2.1不同预处理方法对水稻秸秆糖化效果的影响结果......................……116

2.2不同温度对水稻秸秆糖化效果的影响结果............................……116

2.3不同pH对稻草粉糖化效果的影响结果...............................……117

2.4不同加酶量对稻草粉糖化效果的影响结果............................……118

2.5不同底物浓度对稻草粉糖化效果的影响结果..........................……118

2.6水稻秸秆同步糖化发酵(SSF)结果.................................……119

2.7串联式反应器转化水稻秸秆生产乙醇................................……120

2.7.1固定化NAN一28细胞发酵生产燃料乙醇结果.........................……120

2.7.2串联式生物反应器的稳定性结果..................................……121

2.7.3分批添料式协同酶解发酵生产燃料乙醇结果........................……122

3结论与讨论......................................................··……122

3.1二级串联式生物反应器生产乙醇....................................……122

3.2分批添料式协同酶解发酵工艺......................................……123

3.3水稻秸秆资源的全利用............................................……123

第八章结论.....................................................……124

主要参考文献......................................................……126

英文缩写与主要符号表...............................................……146

本研究的特色与创新.................................................……147

发表与待发表的学术论文及成果.......................................……148

致谢............................................................……149

作者简介..........................................................……150

你要看哪部分？

现在的转基因食品越来越多，那转基因到底是否有害呢？

GM Foods作为一件新的事情，相信很多人仍然比较少。是否有人体的科学依据？是否有人体的科学依据？转基因食物主要是生物技术，某些生物的基因将转移到其他物种中，这反过来整流改革生物的遗传物质的目的，最终使得不良的权衡而没有性和营养质量。和谐。在生活中，每个人都选择含有转基因组分的食物，这在人类健康风险中会相对较低。因此，这些食物实际上能够被消耗。就目前的研究而言，没有足够的证据表明食物对人类健康产生负面影响。在批准转基因食品上市后，尚未发现对人类健康有任何重大危害。因此，消费者可以绑定到自己的需求并具有消费。

许多人不知道遗传修饰育种的繁殖实际上需要进行复杂的测试和测试，与混合养殖相比，没有相关的标准和法规，从这个角度来看，杂交可能产生某种不可预测的风险，这样作为一些毒素涌涌发生的情况。此外，生命中的许多疫苗实际上是由基因工程产生的生物活性蛋白质，可以想象。如果没有基因工程，此时疫苗的价格有多高。转基因往往更准确，其安全性比杂交更可靠。相比之下，杂种繁殖也可能导致缺失一些基因，使许多不像以前那样的种植口味。从这个角度来看，遗传修饰的食物是否对人体有害，在短暂的一段时间内并不容易得出结论，科学家的结论也不同。如果您通常在通常的生活中选择天然食物，那就无疑是最好的。但基于实际情况，这实际上更难以实施。

转基因是使用生物技术将一些生物转移到其他物种中，以改变遗传物质，制备特质，营养素。通过转基因技术，转基因食品，转基因生物和食物物种，它确实是各种食物。有多种食物，取决于食物来源，转基因食品可分为植物转基因食品，转基因酵母疫苗，动物转基因食品等。转基因玉米：遗传修饰的玉米是最常见的遗传修饰食品，与普通玉米相比，转基因玉米形状更加满，并且头部尾颗粒不同。

转基因大豆：转基因大豆也很常见，转基因大豆经常椭圆形，略微平，肚脐是浅棕色，而且豆奶常常乳白色。没有转基因大豆，肚脐是**或**的棕色，含有淡**的大豆牛奶，用非遗传大豆制成的大豆产品将有点**。转基因大米：GM米也很常见，由于其短期的生长，不能充分吸收淀粉，大米颜色透明，当米饭被发现时，发现水稻水不会改变，没有杂质，没有杂质，这种水稻可以是转基因的水稻。如果Moybery是白色的，则存在明显的杂质，可能是非遗传修饰的米饭。