噬菌体疗法治疗细菌多重耐药再添一篇好文

期刊：《Applied and Environmental Microbiology》

影响因子：4.813

近日，派森诺生物与华东理工大学合作，在微生物基因组领域的《Applied and Environmental Microbiology》（影响因子 4.813 ）发表新研究成果！在本研究中，从污水中分离得到了3种杀鲑气单胞菌（ A. salmonicida ）噬菌体，并对其生物学行为进行了研究，其中新分离得到的噬菌体vB_AsM_ZHF对 A. salmonicida 亚种有抑制作用。研究结果表明，该方法可能是一种替代抗生素的方法来保护鱼类免受多药 A. salmonicida 亚种的感染。

研究背景

杀鲑气单胞菌 ( A. salmonicida )是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于水生环境中，可感染多种商业鱼类，导致疖病和细菌性败血症。抗生素可预防和控制水产养殖中的杀鲑鱼感染，然而，随着细菌获得抗生素抗性基因，抗生素的功效会下降。从大菱鲆中分离出的 A. salmonicida 已对多种抗生素产生耐药性。因此，需要一些替代策略来预防和控制水产养殖中的耐多药（MDR）细菌。

噬菌体是感染细菌的病毒，噬菌体疗法已被用于控制人类、动物和植物病原体，许多成功治疗MDR细菌的方法已被报道。因此，噬菌体疗法有可能在临床上用作生物抗菌剂。在本研究种，一种剧毒的 A. salmonicida 亚种噬菌体 vB_AsM_ZHF (ZHF) 和其他两种噬菌体从污水中分离出来，并通过透射电子显微镜 (TEM) 鉴定为肌病毒科的成员，并对其进行全基因组测序和生物学特性验证。结果发现ZHF噬菌体治疗是一种潜在的水产养殖细菌性病害防治策略。

研究材料与方法

1.实验材料： 从上海某水产市场污水中分离得到的3种 A. salmonicida 噬菌体， vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF。

2.测序平台： Illumina MiSeq

3.分析内容： 噬菌体全基因组测序、进化树构建、ANI分析、easyfig比较分析、耐药和毒力基因预测、噬菌体生物学特性实验等等。

研究结果

A. salmonicida 亚种的分离和表征

从中国山东省大菱鲆皮肤溃疡种分离得到一个白色菌落病原菌，命名为AS01。对其进行16S进化树构建发现该菌株为 A. salmonicida ，但是很难区分其亚种。通过KPI体系和vapA序列进行鉴定，确定AS01菌株为 A. salmonicida subsp. masoucida 亚种。

表1 16S鉴定中使用到的菌株

三种噬菌体的分离

从上海一家水产品市场的污水中分离出噬菌体，并根据它们的噬菌斑特征选择噬菌体进行扩增。TEM检测噬菌体形态和大小以区分菌株，并对这3种分离株进行鉴定和命名：vB_AsM_ZHA (ZHA)、vB_AsM_ZHD (ZHD) 和 vB_AsM_ZHF (ZHF)。根据国际病毒分类委员会 (ICTV) 分类系统 (16) 的形态学特征，所有分离株都被归入肌病毒科，尾状病毒目。噬菌体 ZHF 在双层琼脂板上形成清晰的斑块（直径为 3.28 +?0.25 mm），具有明显的晕圈，而 ZHA 和 ZHD 分别形成直径为 2.02+0.47 mm 和 0.51 + 0.15 mm 的混浊斑块。每个噬菌体都可以感染 A. salmonicida ，但是不能感染 A. salmonicida subsp. salmonicida 或其他测试物种。

图1 A. salmonicida phage vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF 的噬菌斑和形态图。

噬菌体的生物学特性

对这三个噬菌体的生物学特性进行研究：结果发现一步生长曲线显示三种噬菌体的生长速率相似，噬菌体 ZHA、ZHD 和 ZHF 的上升期分别为 30、30 和 20min，破裂大小为 110、39 和 284 PFU/细胞；把噬菌体置于各种环境下繁殖以评估稳定性，结果发现每个噬菌体在 36°C 下在 6 至 8 的 pH 水平下保持活性，当PH<3并且温度高于50°C时，噬菌体滴度急剧下降。研究发现，在 MOI 为 1 时，噬菌体 ZHA 的最高产量约为 2*109PFU/ml。ZHD 和 ZHF 的最佳 MOI 为 0.1，噬菌体滴度达到约 3*109PFU/ml（图 2D）。

图2 ?A. salmonicida 噬菌体vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF的生物学特性。

A. salmonicida 亚种的生长曲线结果表明，在0.01至100 MOI的前25h内，每个噬菌体分离物都表现出可接受的抗菌能力。在100 MOI条件下，噬菌体ZHD 感染的杀鲑鱼在25h开始重新生长，而用ZHA和ZHF感染的菌株分别在40h和45h恢复生长，其中感染噬菌体ZHF的细菌在60h时恢复率最低。该菌株的爆裂尺寸最大、细菌再生时间最长、最适MOI最低，这些特征表明，ZHF对 A. salmonicida subsp. masoucida 的体外生长具有最好的抗菌活性。因此，噬菌体 ZHF 用于后续的实验研究。

图3 显示噬菌体 (vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF) 在 MOI 为 100、10、1、0.1 和 0.01 时对 A. salmonicida (AS) 生长的抗菌作用的生长曲线。

噬菌体 vB_AsM_ZHF 的基因组分析。

噬菌体ZHF基因组是一个线性DNA，由 161,887 bp 组成，GC 含量为 41.24%；ORFs 237个，占基因组的149,784 bp（92.52%），平均长度为632 bp。ORFs由40个结构和包装蛋白基因、27个DNA复制/修饰基因、16个转录调控基因、14个代谢基因、3个宿主裂解基因和107个假设蛋白基因组成。毒力基因和耐药基因分析并未发现相关基因。ZHF可能是一种毒性噬菌体，因为在基因组中未发现整合酶基因，使其成为适合噬菌体治疗的噬菌体。

ANI分析结果显示，没有已知的噬菌体基因组与ZHF基因组表现出 100% 相同的序列同源性，这证实了它的新颖性。全基因组序列比对表明，与其他噬菌体菌株相比，噬菌体 ZHF 与气单胞菌噬菌体相似性更高。虽然 A. salmonicida 噬菌体AS-gz的多个基因在基因组中的排列方式不同，但它们在 ZHF 中保留了高 ANI 值。噬菌体 phiAS4 和 AES508 以及窄食单胞菌噬菌体 IME13 的许多基因序列与ZHF相同。其他被分析的噬菌体具有与 ZHF 同源的结构蛋白，但与其他蛋白质的相似性较少。

图4 杀鲑鱼噬菌体vB_AsM_ZHF的基因组特征及比较分析。

噬菌体 vB_AsM_ZHF 对 A. salmonicida subsp.masoucida 的治疗效果。

在大菱鲆中建立 A. salmonicida subsp.masoucida 的挑战模型，每组20只大菱鲆接受 1*104、1*105或1*106?CFU/鱼的i.m.挑战。接种后 20 天 (dpi) 的存活率分别为 60%、10% 和 0%。选择 8*104?CFU/鱼作为 A. salmonicida subsp.masoucida 的攻击剂量，在接下来的实验中大菱鲆感染了该菌，通过ZHF治疗发现，ZHF有可能保护大菱鲆免受 A. salmonicida subsp.masoucida 的侵害。

图5 用 8 * 104CFU/鱼和噬菌体 vB_AsM_ZHF (ip) 以 8 * 102PFU/鱼 (MOI 为 0.01)、8 * 104PFU/鱼的剂量处理的大菱鲆的存活率。

在体内评估细菌负荷和噬菌体滴度，以表征ZHF对 A. salmonicida subsp.masoucida 的动态特性，结果发现在肝脏和脾脏中细菌负荷和噬菌体滴度的变化趋势相似。在最初的2天，肝脏和脾脏中未检测到细菌定植，但在接下来的几天中逐渐增加。与 104CFU/g 的阴性对照相比，治疗组的细菌负荷上升至约 103CFU/g。在头肾组织中，治疗组的细菌负荷在8天内保持低于阴性对照，并且稳定增长。在前2天，治疗组和对照组之间的噬菌体滴度没有差异，但治疗组的噬菌体滴度比对照组下降得更慢。在肝脏和脾脏中，处理组中噬菌体滴度迅速下降8 dpi；而在对照组中，噬菌体ZHF被完全清除。与其他器官相比，头肾组织中清除ZHF的速度更慢。综上所述，ZHF有效地减轻了头肾组织感染的细菌负担，大菱鲆的免疫系统对噬菌体的清除具有延缓作用。

图6 1、2、4 和 8 dpi 时肝脏、脾脏和肾脏中的细菌负荷（左轴）和噬菌体滴度（右轴）。

A.salmonicida subsp. masoucida ?的抗炎作用。

肌肉组织病理切片显示， A. salmonicida subsp. masoucida 在8dpi时可导致炎症细胞浸润，噬菌体治疗后可显著减少炎症细胞的数量进而达到对照组的水平。ZHF相对于细菌感染组1至4 dpi降低血清中白细胞介素1b（IL-1b）水平，并且在8 dpi时血清TNF-a和γ干扰素（IFN-g）水平低于对照组dpi。炎症因子（IL-1b、IL-6、IFN-g、转化生长因子 b [TGF-b]、肿瘤坏死因子 α [TNF-a] 和铁调素）在 1、2、4、通过实时定量 PCR 测量肝脏、脾脏和头肾中的 8 dpi，并通过热图进行可视化 。治疗组的 TGF-b 水平高于感染组，尤其是在 8 dpi 时。相比之下，治疗组第8天IL-1b、第1天IL-6、第2天和第4天脾脏中的IFN-g、第8天铁调素水平低于感染组。这些结果表明，噬菌体疗法有效地降低了体内炎症水平。

图7 体内噬菌体疗法的抗炎作用

研究结论

1.?从污水中分离了一种新的 A. salmonicida subsp. masoucida 噬菌体ZHF，并对其生物学特性进行了鉴定；

2. 对全基因组进行测序分析，未发现抗生素耐药性或毒力基因；

3. 噬菌体治疗模型在大菱鲆体内建立和验证了给药方法，结果发现ZHF显着降低了死亡率、细菌负担和炎症反应，且没有明显的副作用。

综上所述，本研究代表了一种开发噬菌体疗法来控制多重抗生素耐药性 A. salmonicida subsp. masoucida 的策略。

本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。

随着高密度水产养殖的普及，投喂量的增加，池塘中有机物积累问题日益突出，具备超强有机质分解能力和抑菌能力的芽孢杆菌成了调节水质和底质的常用投入品。面对鱼目混杂的巿场现状，作者据其从业经验给出若干购买指南，以期为养户带来帮助。

芽孢杆菌（bacillus）是细菌的－科，生命力强，分布广，目前可利用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等。在水产养殖中应用的主要是枯草芽孢杆菌，其可以直接应用于养殖水体或添加到饲料中使用，而最广泛应用的是作为水质改良剂。

枯草芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜能运动的革兰氏阳性细菌，严格好氧，是我国农业部正式批准使用的益生菌，其耐酸、耐盐、耐高温，能强烈分解碳系、氮系、磷系、硫系污染物,分解蛋白质和复杂多糖,对水溶性有机物分解也有重要的作用,同时可以与养殖环境中的有害藻类及水产致病菌竞争,形成优势种群,抑制有害藻类及水产致病菌，芽孢杆菌在水产养殖中的应用越来越广泛。

随着枯草芽孢杆菌类产品巿场需求越来越大，巿场上各种产品也鱼目混杂。特别是在巨大的商业利益诱惑下，很多厂家不择手段，致使产品质量参差不齐，严重危害了微生态制剂在水产中的应用。所以，养殖户选择枯草芽孢类产品时，要学会分辨产品好坏。笔者根据产品本身性能和作用原理从以下几个方面－－解析。

1、菌株性能

枯草芽孢杆菌的种类有上百种，并不是每一种都有较强的水质改良性能，这需要大量的实验验证和筛选，而很多厂家则直接批量购买芽孢杆菌原粉然后发酵扩增，缺乏定向的原发性筛选，当然对该菌株的理化特性也没有充分了解和研究，用到池塘中效果如何只能看运气了。

2、菌株复配

目前最新研究发现，多种功能协同的枯草芽孢杆菌复配，能大大提高产品性能。而限于研发及资源整合能力，巿场上复配产品基本上是盲目混合而成，缺乏对菌株间协同拮抗性能和菌株特性的研究，导致功能稳定性差、无法协同增效。而国外应用的芽孢产品研究较为充分。

3、发酵工艺

在枯草芽孢杆菌繁殖过程中，液体和固体发酵工艺各有优势（如表l）。液体发酵扩增速度快、固体发酵获得产物酶系更丰富。因此巿场上优质厂家会采用固液联合发酵工艺，使其优劣势互相补充。

4、商业模式

国内水产药品厂家限于成本考虑，无法组建自已的加工厂，更不能投资专业的生产设备，多为直接买入菌粉和复配物进行简单混合、分装，凭借终端低价抢占巿场，而巿场实际需求与产品研发之间完全脱节，只是凭感觉做产品，导致产品质量稳定性较差。

5、加工工艺

从枯草芽孢杆菌的特性来看，休眠菌株必须依附到载体上保存；从产品应用角度看，其需要尽可能粉碎，增加其在水体中的分散度，使菌体分布更均匀，也能增大接触面积，提高产品功效。从目前效果较好的产品特性看，8O目粉碎最合适，过细或过粗都无法协调应用和菌株需求两者之间的平衡。

巿场上常见的产品分为两类：一种是购买菌粉，然后超微粉碎载体，再混合（大于l2O目，粉碎细度极力满足产品应用，但菌株性能被抑制）；另一种是直接用经过充分实验和筛选的复合菌株进行发酵，然后得到发酵产品，然后在不影响菌株性能基础上适当粉碎，一般粉碎细度是8O目。所以在选择产品时，不能单纯判断粉碎越细越好，综合效果评估，选择第二类比较有质量保障。

6、产品包装

常见的枯草芽孢杆菌类产品价格差别很大，包装很多，也不完全符合相关标准，存在包装简陋、虚标菌数、以次充好、夸大功能等现象，并以此误导消费者，还有的包装单薄，运输过程中就导致大量休眠体萌发并死亡，失去应有功效。

小结

枯草芽孢杆菌在水产养殖中拥有非常广泛的应用，也能解决很多养殖问题，但在选择巿场产品时，一定要擦亮眼睛，选择正规厂家、质量过硬的合格产品，避免贪图小便宜造成养殖损失。